黄酮“落新妇苷”与牛血清白蛋白相互作用研究

郑丹，张清峰

(江西农业大学 食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西 南昌,330045)

落新妇苷(图1)是一种广泛存在于植物及其加工食品中的功能性黄酮成分，如龟苓膏[1]、葡萄(葡萄酒)[2]，土茯苓[3]，罗汉茶[4]，贯叶连翘[5]，草珊瑚[6]等。研究表明落新妇苷有多种生物活性,可显著抑制迟发型超敏反应、胶原性关节炎以及免疫性肝损伤[7-8],并可加快小鼠脂肪组织中甘油三酯分解速率[9],及抑制胆固醇合成限速酶HMG-CoA还原酶的活性[10]。落新妇苷具有很强的抗氧化能力[11]，可显著降低小鼠肝脏脂质过氧化水平和提高SOD活性，护肝效果强于VE[12]。

图1 落新妇苷的分子结构Fig.1 The molecular structure of astilbin

食物中的功能性黄酮成分通过肠黏膜吸收进入血液循环后，会与血清白蛋白发生可逆性的结合，从而对黄酮在体内的分布与代谢产生重要影响[13]。由于牛血清白蛋白(BSA)具有与人血清白蛋白相似的序列和构型，因此常作为研究黄酮成分与蛋白相互作用的首选底物。如MA等通过光谱技术研究了7种黄酮类化合物与BSA的相互作用[14]；HOU等研究了4种甘草类黄酮与BSA的相互作用[15]。然后，到目前为止，尚未见落新妇苷与BSA相互作用的研究报道。本文通过研究不同条件下落新妇苷对BSA荧光光谱的影响，并计算了两者结合的热力学参数，从而为了解两者间的相互作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

落新妇苷由本实验室从土茯苓中提取纯化，经过UV、IR、MS、NMR鉴定，纯度>98%。BSA购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。用超纯水配制浓度为5 μmol/L的BSA溶液，用50%的甲醇配制浓度为1×10-3mol/L的落新妇苷母液，放置于4 ℃冰箱备用。用超纯水配制pH=7.4的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(含0.1 mol/L NaCl)。其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

970CRT型荧光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；UV-5200型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；恒温循环水槽，北京长流科学仪器有限公司；微型pH计，杭州齐威仪器有限公司。

1.3 实验方法

将落新妇苷母液用Tris-HCl缓冲液稀释10倍后，分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于 5 mL比色管中，用5%甲醇补足至1 mL，再各加入1mL BSA溶液，最后用Tris-HCl缓冲液定容至5 mL。摇匀后放置30 min，测定荧光强度。设置激发波长为282 nm，发射波长扫描范围为280～450 nm，灵敏度为2，激发和发射的狭缝宽度均为10 nm。同步荧光谱条别设置激发波长为265～365 nm和220～320 nm，发射波长扫描范围均为280～380 nm,使得波长偏移(Δλ)分别为15 nm和60 nm。

1.4 数据统计

实验平行重复3次，取平均值，使用Origin 7.0 (Origin Lab Co., Northampton,MA, USA)软件进行数据统计分析、计算、绘图和曲线拟合。

2 结果与分析

2.1 落新妇苷对BSA荧光光谱的影响

BSA中含有色氨酸残基，可以发射荧光。图2为BSA的荧光发射光谱，BSA的最大激发波长为280 nm，最大发射波长为342 nm。加入落新妇苷会使BSA的荧光强度有规律的降低，即发生荧光淬灭现象，并使其最大发射波长向长波方向移动至355 nm，说明二者有相互作用。荧光淬灭机制可分为静态淬灭和动态淬灭，可根据Stern-Volmer方程(公式1)中淬灭率常数和温度的关系来区别[16]。

F0/F=1+Ksvcq=1+kqτ0cq

(1)

式中：F0和F分别表示加入落新妇苷前后BSA的荧光强度；Ksv表示淬灭常数，单位为L/m；cq表示落新妇苷的浓度，单位为mol/L；kq表示淬灭率常数；τ0表示荧光团的寿命，一般是10-8s。静态淬灭的kq会随温度的升高而降低，而动态淬灭的kq会随温度的升高而增加，故可根据Stern-Volmer方程测定不同温度下落新妇苷对BSA荧光的淬灭率常数kq来判断其淬灭机制。如图3-A和表1所示，在温度280、290、300 K下，其相对应的kq分别为5.510 、5.278和5.174×1012L/(mol·s)。本研究中kq随着温度的升高而降低，表明落新妇苷对BSA的荧光淬灭是一个静态淬灭过程。此外，如果小分子客体对蛋白质等生物大分子的荧光淬灭为动态淬灭机制，kq值通常会小于2×1010L/(mol·s)[17]。

1～9中落新妇苷的浓度为别为0, 2，4，6，8, 10, 12，14，16，18 μmol/L图2 落新妇苷对BSA荧光发射光谱的影响Fig.2 The effect of astilbe on fluorescence emission spectra of BSA

另外，改变BSA浓度为0.5、1、1.5、2 μmol/L，根据Stern-Volmer方程测定290 K条件下落新妇苷对BSA荧光的淬灭率常数kq，结果如图3-B和表1所示，kq随着BSA浓度的增加而增大，从而进一步验证两者的相互作用是一个静态淬灭的过程[18]。

A-不同温度的影响, BSA浓度为1 μmol/L;B-BSA浓度的影响, 温度为290 K图3 Stern-Volmer方程拟合曲线Fig.3 Stern-Volmer equation fitted curve

T/Kkq×10-12/[L·(mol·s)-1]RBSA/(μmol·L-1)kq×10-12/[L·(mol·s)-1]R2805.5100.9930.54.1390.9882905.2780.9921.05.2780.9923005.1740.9691.55.3530.9912.05.5000.997

2.2 落新妇苷与BSA结合的热力学参数

对于一个静态淬灭过程，可通过公式(2)来计算落新妇苷与BSA之间的结合常数Ka以及结合位点数n[14]。

(2)

图4 不同温度下对lgCq的线性图Fig.4 The linear graphs of and lgCq

T/KlgKanRΔG/(kJ·mol-1)ΔH/(kJ·mol-1)ΔS[J·(mol·K)-1]2804.490.950.993-24.072904.670.990.980-25.9320.98161.23004.751.000.992-27.28

热力学参数包括焓变(ΔH)、熵变(ΔS)、自由能变化(ΔG)。根据范特霍夫方程ΔG=ΔH-TΔS及ΔG=-RTlnKa，将lnKa对1/T做图并线性回归可计算得到ΔH和ΔS。如表2所示，ΔG<0，表明落新妇苷与牛血清蛋白的结合反应是自发进行的。ROSS等总结出判断生物大分子与小分子结合性质的热力学规律如下[19]：(1)ΔS>0疏水和静电作用力；(2)ΔS<0氢键和范德华力；(3)ΔH>0、ΔS>0典型的疏水作用力；(4)ΔH<0、ΔS<0氢键和范德华力；(5)ΔH<0、ΔS>0静电作用力。本研究中ΔH>0、ΔS>0，表明疏水作用力在落新妇苷与牛血清蛋白的结合反应中发挥着重要的作用。

2.3 常见离子对落新妇苷与BSA相互作用的影响

同时，也研究这些常见离子对落新妇苷的紫外吸收光谱的影响，结果如图5所示。图中各离子不改变落新妇苷的紫外吸收光谱，说明这些离子不与落新妇苷发生螯合作用。

表3 常见离子对落新妇苷与BSA相互作用的影响Table 3 The effect of common ions on the interaction between astilbe and BSA

图5 常见离子对落新妇苷紫外吸收光谱的影响Fig.5 The effects of common ions on the ultraviolet absorption spectra of astilbe

2.4 同步荧光谱

同步荧光谱是扫描过程中使激发波长和发射波长间保持固定的波长间隔(Δλ)，由测得的荧光强度信号与对应发射波长构成光谱图，它可以反映荧光基团外部微环境的变化。BSA蛋白中主要的荧光基团为色氨酸和酪氨酸残基。设定Δλ为15 nm时，同步荧光谱可以反映酪氨酸残基的特征信息；当Δλ为60 nm时，同步荧光谱可以反映色氨酸残基的特征信息。如图6所示，固定BSA蛋白浓度，随着落新妇苷浓度的升高，同步荧光谱实验结果表明酪氨酸残基的荧光很弱(Δλ=15 nm)，且色氨酸残基的荧光降低速度(Δλ=60 nm)远快于酪氨酸残基，说明色氨酸残基是落新妇苷猝灭BSA内源荧光的主要作用位点。同时，色氨酸残基的同步荧光光谱图峰位位置发生了明显的红移，最大发射波长从341 nm红移至343 nm。这表明落新妇苷对色氨酸残基附近微环境产生影响，同步荧光光谱峰位红移说明BSA色氨酸残基附近疏水环境的极性增大，并且使得肽链的伸展程度有所增加[20]。

A: Δλ=15 nm；B: Δλ=60 nm。BSA浓度为1 μmol/L，1～9中落新妇苷的浓度为别为0, 2，4，6，8,10,12，14，16，18 μmol/L图6 同步荧光谱Fig.6 Synchronous fluorescence spectra

3 结论

落新妇苷可与BSA结合，并通过静态淬灭机制淬灭BSA内源荧光。280K时，落新妇苷与BSA结合常数的lgKa为4.496 3，焓变和熵变等热力学参数说明疏水作用力在两者的相互作用中发挥重要的作用。Ca2+、Mg2+、K+、SO42-及NO2等常见离子对落新妇苷与BSA相互作用的结合常数和结合位点数影响很小。同步荧光光谱研究表明色氨酸残基是落新妇苷猝灭BSA内源荧光的主要作用位点，落新妇苷会使BSA色氨酸残基附近疏水微环境的极性增大。