缺血预处理对大鼠缺血脑组织p-p38MAPK、Fas、FasL蛋白表达的影响

马 飞 邹玉安 薛 茜 张 力

(河北北方学院，河北 张家口 075000)

脑缺血预处理(CIP)可提高大鼠脑组织对缺血再灌注损伤的耐受，保护神经元功能〔1，2〕，而其机制未阐明。CIP可能诱导了抗凋亡机制,通过抑制神经元的凋亡对抗缺血再灌注损伤〔3,4〕。p38MAPK是MAPK家族中的重要成员，激活后的p38MAPK参与对脑缺血后神经细胞凋亡的调控〔5〕；脑缺血损伤后Fas、FasL表达亦明显增高〔6〕，两者都是脑缺血再灌注损伤重要通路。本研究通过观察CIP后p-p38MAPK、Fas、FasL蛋白在大鼠脑组织中的表达变化,探讨CIP对p38MAPK及其下游的Fas/FasL系统的影响及其诱导缺血性耐受的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 SPF级健康雄性SD大鼠90只,体重250～280 g，购自北京华阜康生物科技有限公司〔实验动物许可证：SCXK(京)2014-0004〕。将大鼠随机分为模型组、缺血预处理组及假手术组,每组30只；各组再按观察时间点分为6 h、12 h、24 h、48 h、72 h五组，每小组6只。

1.2主要试剂及材料 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染料(美国Ameresco公司产品)。4%多聚甲醛(天津市光复精细化工研究所产品)。p-p38MAPK一抗体(Bioworld公司产品)。兔抗大鼠Fas、FasL一抗体及相应二抗(武汉博士德生物工程有限公司)。TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒(美国Roche公司产品)。栓线(北京西浓科技有限公司)。

1.3实验仪器 电脑生物组织摊烤片机(浙江金华科迪)；自动脱水机、电脑生物组织包埋机、石蜡切片机、光学显微镜均为德国LEICA 公司产品，真彩病理图文分析系统(德国 LEICA LAS4.0.0)。

1.4动物模型的制备 模型组：采用Longa等〔7〕的大脑中动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型。缺血预处理组：大鼠用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射麻醉，分离暴露右颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈外动脉的远端，将栓线从颈外动脉残端迅速轻柔插入，经颈总动脉分叉部进入颈内动脉，阻断大脑中动脉血流。10 min后从颈外动脉轻轻抽出栓线，完成预缺血。3 d后再次麻醉大鼠，步骤同模型组。假手术组：仅分离右颈总动脉。

1.5神经功能缺损评分 根据文献〔8〕提供方法进行评分，两位协作者在大鼠脑梗死后各观察时间点分别双盲进行评分取均值，评分标准：0分：无神经功能缺损症状；1分：轻度局灶性神经功能缺损,不能完全伸展左前肢；2分：中度神经功能缺损,向左转圈；3分：重度神经功能缺损,向左倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。

1.6脑梗死体积测定 大鼠再灌注24 h后，各组随机选取6只，处死后断头取脑，切除额极与枕极，沿冠状面等分切成5片，脑片浸入2% TTC磷酸盐缓冲液中(放入37℃水浴箱避光孵育)染色30 min，继续4%多聚甲醛中4℃固定24 h，照相测得各层梗死面积。

1.7p-p38MAPK、Fas、FasL蛋白检测 造模成功后在各观察时间点处死各组大鼠，麻醉大鼠，暴露胸腹腔，灌注针从心尖部刺入直至主动脉，剪开右心耳，首先用生理盐水心脏灌注，待冲出的液体变清亮、大鼠四肢苍白后立即换用4%多聚甲醛灌注固定，大鼠全身抽搐僵硬后迅速断头取脑，切片，4%多聚甲醛4℃固定24 h。常规梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。蜡块切片厚度5 μm，采用免疫组织化学(SABC法，按说明操作)检测p-38MAPK、Fas、FasL蛋白表达。

1.8细胞凋亡检测 TUNEL法检测神经细胞凋亡：石蜡包埋的切片常规脱蜡脱水，严格按照TUNEL法原位细胞凋亡检测试剂盒说明操作。光镜下(1×400)在梗死边区随机选取5个互不重叠视野，计数神经元凋亡细胞，计算凋亡指数(AI)=阳性细胞/(阳性细胞+阴性细胞)×100%。

1.9统计学分析 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析及独立样本t检验。

2 结 果

2.1神经功能缺损评分 假手术组大鼠无神经功能缺损症状，评分为0分；模型组大鼠反应差,体重下降，对侧前肢屈曲收缩、不能完全伸展，行走时向左转圈或、倾倒，神经功能缺损评分均>2分;缺血预处理组各时间点神经功能评分显著低于模型组(P<0.05)。见表1。

2.2脑梗死体积测定 模型组大鼠脑梗死体积百分比〔(39.8±2.64)%〕较缺血预处理组明显增大〔(22.2±2.32)%，t=12.322，P<0.05〕。

2.3大鼠脑组织 p-p38MAPK蛋白表达 p-p38MAPK蛋白免疫组化染色显示细胞质及细胞核着色为棕黄色。与假手术组比较，模型组及缺血预处理组p-p38MAPK蛋白表达水平均明显上调(P<0.05)；缺血预处理组较模型组表达明显下降(P<0.05)。见表2，图1。

表1 各组脑缺血后各时间点神经功能评分分)

表2 各组大鼠不同时间脑组织p-p38MAPK蛋白表达(%,

与假手术组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05，下表同

2.4大鼠脑组织Fas蛋白表达 Fas阳性细胞主要分布在细胞质，着色为棕黄色。与假手术组比较，模型组、缺血预处理组Fas蛋白表达水平均明显上调(P<0.05)；缺血预处理组Fas蛋白表达明显低于模型组(P<0.05)。见图2，表3。

2.5大鼠脑组织 FasL蛋白表达 FasL蛋白免疫组化染色显示细胞质着色为棕黄色。与假手术组比较，模型组、缺血预处理FasL蛋白表达水平均明显上调(P<0.05)。缺血预处理组 FasL蛋白表达明显低于模型组(P<0.05)。见表4，图3。

2.6大鼠脑组织凋亡细胞TUNEL法结果 假手术组大脑皮层及海马区偶见凋亡细胞，缺血预处理组及模型组凋亡细胞显著增多。缺血预处理组与模型组比较凋亡细胞数明显减少(P<0.05)。见图4，表5。

图1 各组脑组织p-p38MAPK蛋白表达(DAB，×400)

图2 各组脑组织Fas蛋白表达(DAB，×400)

组别6 h12 h24 h48 h72 h假手术组7.50±1.0511.67±1.8614.171)±2.3213.00±2.379.67±2.16模型组32.33±1.371)34.67±2.161)35.67±2.161)34.33±1.751)33.50±1.381)缺血预处理组18.33±2.801)2)21.17±2.321)2)22.83±2.711)2)21.50±1.871)2)19.50±1.521)2)

表4 各组大鼠不同时间脑组织 FasL蛋白表达(%,

图3 各组脑组织FasL蛋白表达(DAB,×400)

图4 各组脑组织凋亡情况(TUNEL,×400)

组别6 h12 h24 h48 h72 h假手术组9.50±2.0710.33±1.6311.75±1.3714.58±1.7411.92±1.74模型组37.75±2.231)39.25±2.721)40.58±1.721)45.67±1.081)38.92±2.331)缺血预处理组20.42±1.741)2)21.58±1.911)23.25±1.131)2)28.92±1.561)2)21.58±2.461)2)

3 讨 论

缺血预处理是Murry等〔9〕于1986年在犬心肌缺血模型中发现的。Kitagawa等〔10〕首次提出了缺血预处理的概念，阐明了脑缺血耐受现象，即给予轻微的短暂性非致死性脑缺血可以产生确切的脑保护效应，对此后严重的持续脑缺血/再灌注损伤产生耐受，起到减少脑梗死后神经元死亡、促进神经功能恢复等作用。脑缺血再灌注损伤可激活p38MAPK信号通路促进脑神经元凋亡〔11〕。p38MAPK信号通路的活化与Fas、FasL通路关系密切，在脑缺血损伤、细胞凋亡的过程中发挥重要作用〔12,13〕。抑制p38MAPK磷酸化是高压氧预处理诱导神经保护作用的重要机制，与p38MAPK抑制剂(SB203580)诱导的神经保护作用相当〔14〕。缺血后适应可以降低心肌梗死患者血清FasL峰值、减少细胞凋亡〔15〕，提示Fas/FasL系统可能参与脑缺血耐受的机制。以往研究证实CIP可通过抑制p38MAPK磷酸化、减少p-p38MAPK表达而抑制p38MAPK通路活化，从而抑制神经元凋亡〔16～18〕。也有研究发现肢体缺血预处理对肝缺血再灌注有延迟性保护作用,抑制缺血再灌注肝组织p38MAPK的磷酸化是其重要机制之一〔19〕。本研究表明，CIP能提高脑组织对急性缺血性脑损伤的抵抗力,促进神经功能恢复，减少梗死面积，提示缺血预处理可能通过有效抑制p38MAPK磷酸化，抑制Fas、FasL通路的激活,抑制神经元凋亡,从而发挥脑保护作用，抑制p38MAPK的磷酸化及Fas、FasL信号通路的激活可能是脑缺血耐受机制之一。

4 参考文献

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