黄连乙醇提取物对生理及链脲佐菌素致病理状态下小鼠抑郁和焦虑行为的影响

常晓茜 李亚萍 王君明 蔡 泓 陈荣幸 赵恒利 崔 瑛

(河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046)

黄连为毛茛科植物黄连(CoptischinensisFranch.)、三角叶黄连(C.deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云连(C.teetaWall.)的干燥根茎，药性苦寒，归心经，具有清心解郁除烦之功。黄连及其复方如左金丸、黄连阿胶汤等对抑郁症或焦虑症具有治疗作用，且已取得了一些初步的研究进展〔1，2〕。此外，黄连尚有降糖作用〔3〕。链脲佐菌素(STZ)是复制糖尿病常用的工具药，而且，现代研究表明，STZ除了诱发糖尿病之外，尚可引起抑郁和焦虑〔4〕。本研究旨在观察黄连55%乙醇提取物(CCEE)对生理状态及STZ致病理状态下小鼠抑郁和焦虑行为的影响。

1 材料与方法

1.1动物、主要药物与仪器 昆明(KM)小鼠，雄性，SPF级，体质量18～22 g，由河南省实验动物中心提供〔SCXK(豫) 2015-0004〕。黄连：郑州瑞龙制药股份有限公司，产地四川，批号140702，经河南中医药大学药学院生药学科陈随清教授鉴定确认为毛茛科植物黄连(C.chinensisFranch.)的干燥根茎。盐酸二甲双胍片：北京京丰制药集团，批号150715；盐酸氟西汀：常州四药制药有限公司，批号201410103；STZ：Sigma，货号S0130；枸橼酸(分析纯)：天津致远化学试剂有限公司，批号20150201。大小鼠开场活动实验系统：成都泰盟软件有限公司，OFT-100；高架十字迷宫视频分析系统(XR-XG201)，高通量强迫游泳实验系统(XR-XQ202)，高通量悬尾实验系统(XR-XX203)；明暗箱实验系统(XR-XB120)：上海欣欣信息科技有限公司；高速中药粉碎机：浙江省永康市溪岸五金药具厂，HX-200。

1.2CCEE制备 采用黄连根茎粗粉，每1 g黄连粗粉加10 ml体积分数为55%的乙醇(W/V=1∶10)，回流提取2次，每次2 h，4 000 r/min离心10 min，合并离心上清液，回收乙醇至浸膏，55℃减压干燥，称重，4℃保存待用。经计算，黄连醇提物得率为26.44%。

1.3动物实验处理 用0.1 mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH4.2)配制STZ注射液，小鼠在禁食16 h后(不禁水)一次性腹腔注射(ip) STZ(150 mg/kg)造糖尿病模型；造模后的小鼠经过72 h自由饮食后，于尾静脉取血用血糖仪测定血糖值(血糖>11.1 mmol/L为糖尿病模型制作成功)，筛选血糖>11.1 mmol/L的小鼠进入STZ病理状态下实验观测。另取30只小鼠，用于生理状态下(非STZ处理)实验观测。CCEE给予生理状态及STZ病理状态下小鼠的剂量均为低剂量(50 mg/kg)和高剂量(200 mg/kg),阳性药组采用盐酸二甲双胍(MH，100 mg/kg)和盐酸氟西汀(FH，10 mg/kg)联合用药〔灌胃(ig)给药〕，STZ组和溶媒对照组只ig给予等量溶媒(0.5%CMC-Na)，各组连续给药21 d，末次给药后1 h进行行为学测试。

1.4开场实验(OFT)、高架十字迷宫实验(EPM)和明暗箱实验(LDT) OFT：采用OFT系统，将小鼠放于敞箱的中央，观测小鼠在5 min内的运动时间和站立次数。EPM：将小鼠置于装置的迷宫中央，头朝开臂，记录5 min内小鼠进入开臂次数(OE)、进入开臂时间(OT)、进入封闭臂次数(CE)、进入封闭臂时间(CT)，计算小鼠在300 s内的开臂进入次数百分比(OE%)和在开臂滞留时间百分比(OT%)。LDT：将小鼠置于LDT装置的明箱一侧，拉出挡板，立即开始记录实验数据，观察记录小鼠在5 min内的穿箱次数。

1.5悬尾实验(TST)和强迫游泳实验(FST) TST：采用TST系统，距小鼠尾部2 cm处用医用胶带把小鼠尾巴与挂钩粘贴固定，头部向下悬挂，实验时间设置为360 s，记录小鼠在120～360 s内的悬尾不动时间。FST：采用FST系统，将小鼠放于水位为25 cm、水温为25℃的透明的柱状圆桶中，实验时间设置为360 s，记录小鼠在120～360 s内的游泳不动时间。

1.6统计学方法 应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、LSD法及DunnettT3法。

2 结 果

2.1CCEE对生理状态及STZ病理状态下小鼠OFT运动时间和站立次数的影响 与生理状态下的溶媒对照组比较，CCEE高剂量显著升高了生理状态下小鼠在OFT中的运动时间(P<0.01)，而STZ处理后显著降低了小鼠在OFT中的运动时间和站立次数(均P<0.01)；与STZ组比较，阳性药组和CCEE高剂量组均可显著升高STZ小鼠在OFT中的运动时间和站立次数(均P<0.01)，而CCEE低剂量只可显著升高运动时间(P<0.01)，对站立次数无明显影响(P>0.05)。见表1。

表1 CCEE对生理状态及STZ病理状态下小鼠抑郁和焦虑行为的影响

与溶媒对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与STZ组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

2.2CCEE对生理状态及STZ病理状态下TST和FST不动时间的影响 与溶媒对照组比较，CCEE高剂量显著降低了生理状态下小鼠在TST和FST中的不动时间(均P<0.05)，而STZ处理后则显著升高了小鼠在TST和FST中的不动时间(均P<0.01)；与STZ组比较，阳性药组和CCEE高剂量均可显著降低STZ小鼠在TST和FST中的不动时间(均P<0.01)，而CCEE低剂量只可显著降低在TST中的不动时间(P<0.01)，而对在FST中的不动时间则无明显影响(P>0.05)。见表1。

2.3CCEE黄连醇提物对生理状态及STZ病理状态下小鼠在EPM的OE%和OT%的影响 与溶媒对照组比较，CCEE高剂量显著升高了生理状态下小鼠在EPM中的OE%(P<0.05)，而STZ处理后则显著降低了小鼠在EPM中的OE%和OT%(分别P<0.01，P<0.05)；与STZ组比较，阳性药组和CCEE高剂量均可显著升高STZ小鼠在EPM中的OE%和OT%(P<0.05或P<0.01)，而CCEE低剂量对此则均无明显影响(均P>0.05)。见表1。

2.4CCEE对生理状态及STZ病理状态下小鼠LDT穿箱次数的影响 与溶媒对照组比较，STZ处理后显著降低了小鼠在LDT的穿箱次数(P<0.01)，而CCEE的低剂量和高剂量在小鼠生理状态下对此均无明显影响；与STZ组比较，阳性药组、CCEE低剂量及高剂量均可显著升高STZ小鼠在LDT中的穿箱次数(分别P<0.01，P<0.05，P<0.01)。见表1。

3 讨 论

糖尿病患者饮食受限、生活质量下降更易引发抑郁、焦虑等负面情绪，终而导致糖尿病并发抑郁症或(和)焦虑症。再者，抑郁症或(和)焦虑症患者缺乏运动且饮食不规律，服药依从性差，更加不利于糖尿病的治疗，二者之间的相互影响也加大了糖尿病抑郁症或(和)焦虑症的治疗难度。中医药具有注重整体调节、药物天然易得、多靶点效应等特点和优势，能够有效地降低血糖和预防糖尿病并发症。从中药中开发针对糖尿病及其并发症的安全高效药物，已成为研究热点之一〔5〕。

TST和FST是抑郁症及抗抑郁药筛选常用的实验测试工具，动物在这两种测试中的不动时间如果明显升高，常表示动物处于行为绝望的抑郁状态，反之则表示药物可能具有抗抑郁作用〔6〕。本研究提示CCEE高剂量对生理状态下小鼠具有抗抑郁作用。STZ可诱导小鼠的抑郁行为，这与文献报道的结果一致〔7〕。CCEE高剂量对生理状态下和STZ糖尿病病理状态下小鼠的抑郁行为均有明显改善作用，而CCEE低剂量只对STZ糖尿病病理状态下小鼠的抑郁行为具有明显改善作用，而对生理状态下小鼠的抑郁行为无明显影响，一定程度上提示CCEE对STZ糖尿病病理状态下的抗抑郁作用较对其生理状态下的作用更为敏感。推测这可能与CCEE既可针对STZ病理状态下的高血糖进行干预，又可针对STZ病理状态下的抑郁行为进行治疗，即与这样的一种双重作用有关。

EPM和LDT是焦虑症及抗焦虑药筛选常用的实验测试工具。动物在EPM测试中的OE%或(和)OT%如果明显降低，常表示动物处于焦虑状态，反之表示药物可能具有抗焦虑作用〔8〕；同样，在LDT测试中的穿箱次数如果明显降低，则常表示动物处于焦虑状态，反之则表示药物可能具有抗焦虑作用〔7〕。在本研究中，之前CCEE高剂量仅从OE%的分析层面呈现出了明显的抗焦虑作用，而CCEE低剂量在EPM和LDT测试中均未呈现出抗焦虑作用。STZ处理诱导了小鼠的焦虑行为，这与之前报道的结果一致〔9〕。CCEE高剂量对小鼠在STZ糖尿病病理状态下的焦虑行为均具有明显改善作用；CCEE低剂量只可使该病理状态下小鼠在LDT的穿箱次数显著升高，提示至少从LDT测试的角度来说，CCEE低剂量对STZ糖尿病病理状态下小鼠的焦虑行为具有明显改善作用。进一步总结分析可知，CCEE高剂量对生理状态下和STZ糖尿病病理状态下小鼠的焦虑行为均有明显改善作用，而CCEE低剂量只对STZ糖尿病病理状态下小鼠的焦虑行为具有明显改善作用，而对生理状态下小鼠的焦虑行为无明显影响，一定程度上提示CCEE对STZ糖尿病病理状态下的抗焦虑作用较对其生理状态下的作用更为敏感。推测这可能与CCEE既可针对STZ病理状态下的高血糖进行干预，又可针对STZ病理状态下的抑郁行为进行治疗，即与这样的一种双重作用有关。

此外，本研究中，MH和FH联合用药对STZ病理状态下的抑郁和焦虑行为均起到了较好的治疗作用，实际上这不仅与MH的降糖作用及FH的抗抑郁作用有关，还可能与FH的抗焦虑〔10〕、MH的抗焦虑〔11〕和抗抑郁〔12〕的综合作用有关。

综上所述，本研究证实了CCEE高剂量对生理状态及STZ病理状态下小鼠抑郁和焦虑行为均有改善作用，而CCEE低剂量仅对STZ病理状态下小鼠的抑郁和焦虑行为具有改善作用。一定程度上，CCEE对STZ 糖尿病病理状态下的治疗作用较对其在生理状态下的治疗作用更为敏感。

4 参考文献

1张月月,王君明,崔 瑛,等.中药生物碱类成分抗焦虑或抑郁活性及黄连生物碱药理作用研究进展〔J〕.中华中医药杂志,2015;20(4):1184-7.

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3马 航,胡慭然,邹宗尧,等.黄连生物碱降糖作用研究及构效关系初探〔J〕.中国药理学通报,2015;31(11):1575-9.

4Lenart L,Hodrea J,Hosszu A,etal.The role of sigma-1 receptor and brain-derived neurotrophic factor in the development of diabetes and comorbid depression in streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕.Psychopharmacology(Berl),2016;233(7):1269-78.

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7Castillo-Gómez E,Coviello S,Perez-Rando M,etal.Streptozotocin diabetic mice display depressive-like behavior and alterations in the structure,neurotransmission and plasticity of medial prefrontal cortex interneurons〔J〕.Brain Res Bull,2015;116:45-56.

8Cui Y,Rong C,Wang J,etal.Mechanism-based anti-anxiety effects of polysaccharides extracted from shudihuang(radix rehmanniae preparata) by two-dimensional electrophoresis analysis in rat hippocampus proteins〔J〕.J Tradit Chin Med,2013;33(4):524-30.

9Gupta D,Radhakrishnan M,Kurhe Y.Insulin reverses anxiety-like behavior evoked by streptozotocin-induced diabetes in mice〔J〕.Metab Brain Dis,2014;29(3):737-46.

10Ansai S,Hosokawa H,Maegawa S,etal.Chronic fluoxetine treatment induces anxiolytic responses and altered social behaviors in medaka,Oryzias latipes〔J〕.Behav Brain Res,2016;303(1):126-36.

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