奶牛NKA1B2基因intron4上C2833T与耐热指标及产奶量的关联分析

韩业东，张振梅

（1.辽宁省畜产品安全监察所，辽宁 沈阳 110003；2.沈阳市动物卫生监督所，辽宁 沈阳 110000）

Na+-K+-ATP酶（NKA），是一类广泛存在于真核生物细胞膜上的跨膜载体蛋白，是细胞内离子转运和能量代谢的重要系统，直接或间接地参与细胞内外的离子调节，机体的生理活动和体温调节过程。研究发现，细胞内Na+和K+的平衡主要有NKA来调节，NKA活性的降低可引起细胞的离子跨膜转运障碍，能量代谢和物质代谢的紊乱。多位学者证实在炎热的夏季，持续高温造成的热应激可导致奶牛直肠温度、呼吸频率、红细胞钾、产奶量发生明显的变化。研究发现，荷斯坦牛红细胞NKA活力与产奶量下降率极显著负相关。在本研究中，我们对荷斯坦奶牛NKA1B2基因内含子4上的SNP进行群体遗传学分析，从不同基因型分析对产奶量的影响以及对体温，钾离子，红细胞钠钾泵的变化，以其为荷斯坦耐热奶牛的选育提供理论依据和参考指标。

1 材料和方法

1.1 试验动物

从规模化奶牛场中随机挑选具有完整DHI记录（乳脂率、乳蛋白率、305天产奶量及体细胞数）的同一胎次中国荷斯坦奶牛836头。所有生产数据通过Foss 6000乳成分及体细胞联机分析系统检测获得。体温分阶段场内测定，生化指标实验室测定。静脉采血(10毫升/头)，ACD抗凝，-20℃保存。

1.2 NKA1B2的SNP检测

根据牛NKA1B2基因全序列(NCBI登录号：NC_007317-2)，使用Primer5.0软件，设计2对引物(见表1)。以DNA池为模板，按照（PCR反应体系均为25微升，包括10×buffer2.5微升，25毫摩尔/升Mg2＋1.8微升，10毫摩尔/升dNTPs0.5微升，10微摩尔/升上、下游引物各0.8微升，模板DNA 1.0微升，5单位/微升Taq DNA 聚合酶0.5微升，三蒸水17.1微升。PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，退火（退火温度见表1）30秒，72℃延伸30秒，35个循环， 最后72℃延伸7分钟）PCR体系进行反应，PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测合格后测序。

1.3 NKA1B2基因分型

用PCR-SSCP来进行基因分型，方法是把6微升PCR产物加入25微升离心管中，然后再加入9微升变性剂（95%甲酰胺，25毫摩尔EDTA，0.025%二甲苯青，0.025%溴酚蓝），98℃变性10分钟，迅速冰浴5分钟。变性的DNA用10%PAGE电泳（80×73×0.75毫米），1×TBE buffer，稳压（120伏），4℃，电泳10～14小时，用0.1%硝酸银进行染色，根据PCR-SSCP电泳结果判断每一个体的基因型。

1.4 耐热评定指标的测定

将-20℃的ACD抗凝血5毫升，静置溶解后于4℃、3000转/分钟离心30分钟，分离血清抽提基因组DNA（酚-氯仿法），然后按1∶2体积加入生理盐水， 轻轻摇匀，4℃、7000转/分钟离心8分钟，弃上清，重复洗3次，最后制得纯净的红细胞。用移液枪插入试管底部， 准确吸取0.5毫升红细胞转移到加有1毫升灭菌生理盐水的1.5毫升离心管中，标号冷藏待测红细胞k+（原子吸光法），剩余的红细胞用于制备红细胞膜（低渗溶血法），测定红细胞NKA活力（无机磷比色法）。

1.5 数据的统计分析

统计中国荷斯坦奶牛的基因频率和基因型频率，计算χ2值、多态信息含量(PIC)、有效等位基因数(Ne)和位点的杂合度(H)。在最小二乘法拟合线性模型中用SPSS13.0软件比较中国荷斯坦奶牛的乳脂率、乳蛋白率、305天产奶量、体细胞评分（SCS）在不同基因型之间的差异。分析中使用固定效应的线性模型是：Yijkil=u+hi+pj+sk+ml+eijkli（其中：Yijkil=耐热性能观察值；u=群体均值；hi=基因型的固定效应值；pj=父本的固定效应值；sk=母本的固定效应值；ml=产奶性能效应值；eijkli=随机残差效应）。结果以“平均数±标准误”的形式表示。

2 试验结果

2.1 扩增产物电泳，测序和分型

PCR扩增经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，都产生了清晰的、能够准确判断的目的条带756bp和173bp，随机抽取部分样本进行两次重复测序，同时发现第4内含子的C2833T突变，通过PCR-SSCP分型，发现3种基因型CC、CT和TT，见图1。

图1 NKA1B2基因的C2833T位点特征

2.2 群体遗传学分析

P C R-S S C P检测到C2833T位点具有两个等位基因（C、T），三种基因型（C C、C T、T T），等位基因频率和基因型频率、多态信息含量（PIC）、杂合度（H）、有效等位基因数（Ne）、卡方（χ2）见表2。

表1 引物设计

表2 C2833T在荷斯坦牛群体中的遗传多样性

表3 NKA1B2基因不同基因型个体的产奶量

表4 NKA1B2基因不同基因型个体的体温

表5 NKA1B2基因不同基因型个体红细胞k+

表6 NKA1B2基因不同基因型个体的红细胞NKA

2.3 NKA1B2不同基因型与产奶量的相关分析

表3分析中国荷斯坦牛NKA1B2基因2833位点的CT基因型个体产奶量在热应激期显著低于TT基因型个体，在非热应激期CT基因型个体产奶量显著低于CC和TT基因型个体。

2.4 NKA1B2不同基因型与耐热评定指标的相关分析

由表4可知，中国荷斯坦牛NKA1B2基因2833位点的CT基因型个体体温在热应激期极显著高于CC和TT基因型个体。

由表5可知，中国荷斯坦牛NKA1B2基因2833位点的CT基因型个体红细胞k+在热应激期显著高于TT基因型个体。

由表6可知，中国荷斯坦牛NKA1B2基因2833位点的TT基因型个体红细胞NKA活力在热应激期显著高于CC和TT基因型个体。

3 讨论

热应激期，中国荷斯坦牛体温升高、红细胞K+、产奶量和红细胞NKA活力都降低，这与李建国、穆玉云、史彬林、杨淑晶的研究结果相一致；TT基因型个体在热应激期表现出体温较低，红细胞钾低，产奶量下降率低，NKA活力下降率低的优良特征，具有很好的耐热性。许多研究表明NKA与多种疾病有关，一般都有NKA活性的下调，可引起细胞的离子跨膜转运障碍，能量代谢和物质代谢紊乱。红细胞NKA是细胞从胞外摄取K+的唯一途径，NKA活性抑制，导致细胞摄取K+的能力降低；NKA活性降低，将不能利用ADP的磷酸化生成ATP使体内底物氧化释放的能量以热的形式散发，导致体温升高，但NKA在热应激过程中活性下调导致体温升高是否遵循ATP的偶联机制有待研究论证；哺乳动物成熟的红细胞所需能量几乎完全依靠葡萄糖酵解而取得，酵解产生的ATP主要用于维持细胞膜上的NKA的运行，如ATP缺乏，则膜内外离子平衡失调，使动物细胞质膜中依赖于离子梯度形式贮存的能量推动的糖和氨基酸的代谢发生紊乱，这与热应激期产奶量的下降是否关联有待进一步研究。在生产中奶牛热应激时，采食量下降，Na+、K+等摄入减少，唾液分泌增加，皮肤汗液蒸发量增加，也导致体温升高，血液中Na+、K+损失和产奶量的下降。因此，作者认为，奶牛在热应激的初始阶段，通过物理性的调节，改变自身的呼吸频率，体温，唾液和汗液的分泌来抵抗外界高温环境，而持续热应激时，就需要化学性的调节，改变体内的激素分泌，ATP水解和物质代谢来抵抗持续高温。在夏季生产中看到奶牛采食减少、站立不动、吐舌流哈、体表隐汗和检测到体温升高、产奶量下降、红细胞K+下降、红细胞NKA活力下降等各种生理生化指标的显著变化可以客观的验证奶牛处于热应激。

4 结论

本研究测序发现中国荷斯坦牛NKA1B2基因的第4内含子存在新的SNP位点C2833T，PCR-SSCP分型发现3种基因型CC、CT和TT，都与产奶量及生理生化指标存在显著相关，且TT基因型个体相对具有优越的产奶量和良好的热应激抵抗性。因此，NKA1B2基因C2833T可能作为荷斯坦奶牛耐热性能评定的分子遗传标记，但仍需加大样本量和试验研究论证。