复方鳖甲软肝片对二乙基亚硝胺所致原发性肝癌大鼠肝组织PCNA和α-SMA表达的影响*

高翔，尚双艳

肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，死亡率高居我国所有恶性肿瘤的第二位[1-3]。近年来，中医药被大量用于防治多种类型的恶性肿瘤，并取得了较大的成就[4-5]，但如何寻找有效的抗肝癌中药是临床亟需解决的重要课题[6]。复方鳖甲软肝片具有化瘀解毒，益气养血之功效，临床常用于治疗肝硬化[7]。本研究观察了复方鳖甲软肝片对二乙基亚硝胺所致原发性肝癌大鼠肝组织增殖细胞核抗原（PCNA）和平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器、药物与试剂 40只清洁级雌性SD大鼠，体质量 151～172 g，平均体质量（159.4±13.4）g，购自西北农林科技大学实验动物中心，许可证号：SCXK（陕）2016-1128。AS-SA1型全自动血液分析仪（美国博大精密器械公司），EP-02型超高速离心机（德国昂奋实验仪器公司），Olympus 21型显微照相系统（日本奥林匹斯公司）。羧甲基纤维素钠（陕西安义生物制品有限公司），二乙基亚硝胺（DEN，中国标准化研究院，于使用前配制成浓度为100 mg/L的DEN溶液，避光存放，每12 h更换）。复方鳖甲软肝片（内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司），兔抗PCNA和抗α-SMA抗体（南京建成生物制品研究所）。

1.2 原发性肝癌大鼠模型的制备[9]将大鼠随机分为对照组、模型组、小剂量和大剂量复方鳖甲软肝片处理组。依据文献报道[8]，确定动物给药剂量，即大鼠剂量（mg.kg-1）=成人剂量（mg.kg-1）×6.25，其中成人体质量以60 kg计，复方鳖甲软肝片的一般人体剂量为6.0 g/60 kg=0.1 g.kg-1，折合每只大鼠为0.1×6.25=0.625g.kg-1，故本研究小剂量组给药剂量为0.625 g.kg-1，大剂量组给药剂量为1.25 g.kg-1。对除对照组外的其它各组大鼠进行造模处理：给予大鼠50%四氯化碳大豆油溶液3 mL.kg-1，后肢皮下注射，2次/w，注射4 w后休息2 w，于第6 w开始，将大鼠饮用水更换为95 μg.mL-1的DEN水溶液，每日更换1次，连用20 w；在对照组大鼠，则皮下注射等量空白大豆油，并给予普通饮用水。在小剂量组和大剂量复方鳖甲软肝片处理组，大鼠在开始饮用DEN溶液时，即开始给予相应剂量的复方鳖甲软肝片（经生理盐水溶解，配制成密度为1.30 g/mL的液体）灌胃，1次/d，连续给药20 w，在对照组和模型组则给予等量生理盐水灌胃。在末次给药后24 h，应用乙醚麻醉动物，采用腹主动脉取血法取血4 mL，于低温下3000 r/m离心2 min，分离血清，保存于-80℃冰箱待检测。采取放血法将各组大鼠处死，取肝脏，记录各组大鼠肝脏癌变只数、表面癌结节数和肝脏质量，计算各组肝脏指数（肝脏质量/体质量×100%）及癌变率（癌变只数/总数×100%）。将肝组织平均分为3部分，保存于-80℃冰箱，其中1份在10%甲醛溶液中固定，依次进行脱水、透明及浸蜡处理，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色后进行常规组织学观察。

1.3 血清生化指标检测 常规检测（武汉博士德生物科技有限公司）。

1.4 肝组织PCNA和α-SMA检测[10]组织切片4 μm，常规脱蜡，采用SP法检测，抗PCNA和抗α-SMA工作浓度分别为1∶200和1∶500。PCNA蛋白阳性表达为细胞核染色，而α-SMA蛋白阳性则为胞质呈黄色颗粒。应用Image-proplus 6.0图像分析软件对上述阳性染色细胞进行半定量分析。

1.5 统计学处理 应用SPSS 19.0软件对数据进行处理，计量资料以(±s)表示，采用t检验，多组比较采用方差分析；计数资料采用x2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏一般情况的比较 模型组肝脏癌变率为100%，提示本研究中造模较为成功；与模型组大鼠比，对照组、大剂量和小剂量复方鳖甲软肝片处理组大鼠肝脏质量、肝脏癌变率、肝脏指数和肝表面癌结节数均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组比，大剂量和小剂量复方鳖甲软肝片处理组大鼠肝脏质量、肝脏癌变率、肝脏指数和肝表面癌结节数均明显增高，差异有统计学意义（P<0.05,表1）。

表1 各组肝脏一般资料(%，±s)比较

表1 各组肝脏一般资料(%，±s)比较

与模型组比，①P＜0.05；与对照组比，②P＜0.05

只数 肝脏质量（g） 肝脏指数 肝脏癌变 表面癌结节（个）对照组 10 13.16±1.34① 1.82±0.24① 0（0.0）① 0.00±0.00①模型组 10 25.59±2.38② 4.95±0.58② 10（100）② 14.14±2.37②大剂量 10 17.34±1.78①② 3.10±0.72①② 1（10.0）①② 3.16±0.45①②小剂量 10 19.89±1.80①② 3.89±0.81①② 3（30.0）①② 7.38±1.01①②

表2 各组肝功能指标(±s)比较

表2 各组肝功能指标(±s)比较

与模型组比，①P＜0.05；与对照组比，②P＜0.05

只数 TBIL(μmol/L) AST(IU/L) ALT(IU/L) ALB（g/L）对照组 10 23.12±1.92① 86.46±9.14① 21.34±2.40① 38.48 ± 2.72①模型组 10 72.41±8.48② 278.26±27.34② 141.38±16.02② 26.32± 2.02②大剂量 10 53.58±4.15①② 167.58±17.30①② 49.27±5.16①② 33.14 ± 2.31①②小剂量 10 61.04±5.13①② 201.45±23.45①② 91.34±11.45①② 30.48 ± 2.22①②

2.2 各组大鼠肝功能指标比较 与模型组大鼠比，对照组、大剂量和小剂量复方鳖甲软肝片处理组大鼠血清TBIL、AST和ALT均明显降低，TP和ALB含量明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组大鼠比，大剂量和小剂量复方鳖甲软肝片处理组大鼠血清TBIL、AST和ALT均明显增高，而TP和ALB则均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，表2）。

2.3 各组大鼠肝组织病理学变化情况的比较 对照组大鼠肝组织肝小叶结构正常，无炎性细胞浸润；模型组大鼠肝组织癌细胞呈不同程度的分化，排列成巢状，且核仁突出；在10只小剂量复方鳖甲软肝片处理组中，3只大鼠出现了肝组织癌变，癌变大鼠肝组织癌细胞核仁突出，呈现巢状或梁状排列，但明显轻于模型组，未癌变的大鼠肝组织则存在较为严重的坏死性肝硬化，且肝细胞有严重水肿、变性、坏死；大剂量复方鳖甲软肝片处理组中仅1只出现了肝组织癌变，癌变大鼠肝组织癌细胞核仁较突出，呈现梁状排列，但明显轻于模型组，未癌变的大鼠肝组织则出现不同程度的坏死性肝硬化，肝细胞水肿、变性、坏死，其程度明显轻于小剂量复方鳖甲软肝片处理组中未发生癌变的大鼠（图1）。

图1 各组大鼠肝组织病理学表现（HE，400×）

2.4 各组大鼠肝组织PCNA和α-SMA表达情况 模型组大鼠肝组织PCNA和α-SMA均呈现强阳性表达；大剂量和小剂量复方鳖甲软肝片处理组大鼠肝组织PCNA和α-SMA阳性表达程度均明显弱于模型组；对照组大鼠肝组织则仅偶见两种物质的阳性表达细胞。半定量分析结果表明，对照组、大剂量和小剂量复方鳖甲软肝片处理组大鼠肝组织PCNA和α-SMA相对表达量均明显低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）；与对照组比，大剂量和小剂量复方鳖甲软肝片处理组大鼠肝组织PCNA和α-SMA相对表达量均明显增强，差异有统计学意义（P<0.05，图 2、图 3、表 3）。

图2 各组大鼠肝组织PCNA表达情况（SP，400×）

图3 各组大鼠肝组织α-SMA表达情况（SABC，400×）

表3 各组大鼠肝组织PCNA和α-SMA相对表达量(±s)比较

表3 各组大鼠肝组织PCNA和α-SMA相对表达量(±s)比较

与模型组比，①P＜0.05；与对照组比，②P＜0.05

只数 PCNA表达量 α-SMA表达量对照组 10 1.00±0.00① 1.00±0.00①模型组 10 19.59±2.67② 25.12±3.19大剂量组 10 5.98±1.12①② 7.96±1.37①②小剂量组 10 9.23±1.34①② 12.34±2.88

3 讨论

采用DEN建立大鼠原发性肝癌模型，操作较为简单且成功率高，同时动物在造模期间死亡率较低，已被广泛用于原发性肝癌的药物研发研究[11，12]。大鼠在服用DEN的早期阶段肝脏可出现肝细胞变性及坏死等中毒性反应，而在诱癌的中期阶段，可出现肝细胞再生及肝纤维化等现象，晚期阶段则在肝细胞出现结节性增生及肝硬化等后动态演变形成肝癌，上述变化与人类原发性肝癌发病过程基本相似，故其模拟程度较高[13，14]。本研究模型组大鼠全部出现肝癌，说明本方法造模可靠性高。

复方鳖甲软肝片主要由鳖甲、当归、冬虫夏草、党参、板蓝根、莪术、黄芪、赤芍、三七、紫河车和连翘等药材组成，具有益气养血、软坚散结及化瘀解毒等功效，常用于治疗肝硬化、慢性乙型肝炎肝纤维化等肝脏疾病[15]。方中冬虫夏草、党参、黄芪、当归等均具有较好的抗肿瘤活性，正是由于复方鳖甲软肝片具有较好的抗癌物质基础，我们用其干预DEN所致原发性肝癌动物，期望为该药的新型应用提供一定的依据[16]。PCNA是一种细胞增殖标志物，可协调癌细胞DNA合成，是肿瘤细胞增殖所必需的一种蛋白，作为一种重要的肿瘤标志物，其表达情况可有效反映肿瘤细胞的增殖水平，尤其在肝癌及鼻咽癌等组织分化较差的恶性肿瘤，该蛋白的表达水平较高[17，18]。α-SMA可促进肝组织星状细胞的活化，后者可参与介导免疫抑制活性，诱导大鼠肝癌细胞的增殖和肿瘤细胞的迁移，故该蛋白在原发性肝癌的发病进程中扮演着极为重要的角色[19，20]。

本研究大剂量和小剂量药物处理组大鼠肝脏质量、肝脏癌变率、肝脏指数和表面癌结节数均明显低于模型组，提示复方鳖甲软肝片能够有效缓解DEN诱导的肝损伤，改善其肝功能，降低肿瘤的发生率。此外，大剂量和小剂量处理组大鼠肝组织PCNA和α-SMA表达量均明显低于模型组，提示复方鳖甲软肝片可抑制肝癌细胞的增殖及肝星状细胞的激活，从而减轻了DEN所致肝纤维化及肝硬化，在一定程度上延缓了大鼠肝脏的癌变进程，上述结果可能是本研究发现的复方鳖甲软肝片防治原发性肝癌的主要作用机制之一。然而，本研究应用的大剂量和小剂量中药未表现出明显的量效关系，且对于药物的具体作用机制探讨还不深入。因此，有关复方鳖甲软肝片影响原发性肝癌进程的实验设计及其详细作用机制还有待于更进一步的研究。