胆管细胞癌组织S100A6 mRNA及其蛋白表达变化*

李福荣，牛福勇，李华

胆管细胞癌是指发生于肝内胆管的癌肿，属原发性肝癌的一种[1]。胆管细胞癌的病因至今尚不清楚，已有报道指出胆道慢性炎症和感染、胆管或胆囊结石的慢性刺激、溃疡性结肠炎、先天性胆管囊肿、肝吸虫感染、胆道手术史、原发性硬化性胆管炎、乙型肝炎病毒感染、胆管癌基因突变等因素与胆管癌发生密切相关[2-4]。近年来，胆管细胞癌的发病率及死亡率在全球范围内有升高的趋势。随着影像学检查手段和胆管细胞癌相关生物分子的检测对胆管癌的早期诊断、转移发现及预后判断方面取得了重要的进展。S100钙结合蛋白 A6（S100 calcium-binding protein A6，S100A6）是 S100 家族成员，主要通过与Ca2+以及靶向蛋白相互作用，参与细胞周期调节、基因转录、细胞增殖及分化等过程[5，6]。有研究报道指出，有效沉默S100A6基因可有效抑制食管癌细胞的增殖和迁移能力[7]，而在结肠癌，S100A6的表达对肿瘤的发生发展起着重要的促进作用[8]。本研究检测了胆管细胞癌组织S100A6 mRNA水平及其蛋白表达的变化，并分析了其与实验室检测指标和临床病理学参数的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2008年1月～2014年12月在我院接受手术切除、术后经病理学检查证实的胆管细胞癌患者40例，男26例，女14例；年龄39～79岁，平均年龄（59.68±14.53）岁。根据国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）标准对胆管细胞癌组织进行TNM分期，根据Lauren's分型标准进行组织病理学分型。TNM分期：I期12例，II期16例，III期12例；肿瘤分化：高分化7例，中分化19例，低分化14例。排除伴有心、肺、肾等重要脏器严重疾病患者。选择同期在本院就诊的胆道良性疾病患者40例作为对照，男22例，女18例；年龄37～80岁，平均年龄（58.77±14.68）岁。包括胆囊结石18例，胆囊息肉12例，急性胰腺炎2例，慢性胆囊炎8例。本研究获得我院医学伦理学委员会批准，由直系亲属签署知情同意书。随访截止日期为2015年12月31日。

1.2 组织S100A6 mRNA及其蛋白检测 自-80℃低温冰箱中取出待检的胆管细胞癌组织、癌旁组织、肝组织25～40 mg，按照RNA提取试剂盒（Omega公司）说明书要求提取总RNA，并以此为底物进行Real-time PCR。引物，S100A6 F:5'-CTCACCATTGGCTCGAAGCT-3'，R:5'-GTTCACCTCCTGGTCCTTGTTC-3'；GAPDH F:5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，R:5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'。扩增条件为:95℃ 3 min，94℃ 30 s，55℃ 退火30 s，72℃30 s，30个循环。以△Ct(目的基因)-△Ct（内参基因）计算实验组和对照组的△Ct，按照△△Ct=△Ct（实验组）-△Ct（对照组）计算mRNA相对水平的差值，即2-△△Ct。提取各组织蛋白，测定蛋白浓度。常规行Western blot（一抗、二抗购自Sigma公司），主要包括蛋白质样品获得、考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白、SDS-PAGE、电转移、免疫反应等过程。以目的蛋白与内参照蛋白GAPDH的积分吸光度比值表示蛋白相对表达量。

1.3 血清S100A6水平、血常规、血生化和肿瘤指标检测 采用ELISA法检测血清S100A6（美国R&D systems公司）；使用深圳雷杜公司RT7200全自动血液分析仪和日本奥林巴斯公司AU2700型全自动生化分析仪检测血常规、生化指标和CA125、癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、C反应蛋白（CRP）。

1.4 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料采用x2检验。采用Spearman秩相关分析。采用非条件Logistic回归单因素或多因素分析。多分类变量以哑变量形式进入回归模型，变量入选标准为α≤0.05，剔除标准为α＞0.05。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异非常显著。

2 结果

2.1 不同组织S100A6 mRNA及其蛋白表达情况 在40例癌旁组织和肝组织中，S100A6蛋白分别阳性8例（20%）和12例（30%），显著低于肝内胆管癌组织的 26例（65%，P＜0.05）；癌旁组织和肝组织 S100A6 mRNA相对水平显著低于肝内胆管癌组织（P＜0.05）；癌旁组织和肝组织S100A6蛋白相对表达量显著低于肝内胆管癌组织（P＜0.05，表1）。

表1 不同组织S100A6 mRNA及其蛋白水平（±s）比较

表1 不同组织S100A6 mRNA及其蛋白水平（±s）比较

例数 mRNA水平 蛋白表达量癌旁组织 40 0.92±0.33 0.56±0.16肝组织 40 1.12±0.46 0.85±0.46癌组织 40 1.93±0.57 1.63±0.51

2.2 胆管细胞癌患者血清S100A6水平及其与实验室检测指标的相关性 40例胆管细胞癌患者血清S100A6水平为（2456.85±128.31）pg/ml，显著高于对照组的（2234.26±116.35）pg/ml（P＜0.05）；血清S100A6与CEA或CRP呈正相关（P＜0.05），与其它指标无相关性（P＞0.05，表 2）。

表2 胆管细胞癌患者血清S100A6与实验室检测指标的相关性分析

2.3 胆管细胞癌患者血清S100A6水平与临床病理学参数的相关性 胆管细胞癌患者血清S100A6水平与性别、年龄无相关性（P＞0.05），与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、肿瘤分化程度呈正相关（P＜0.05，表 3）。

表3 胆管细胞癌患者血清S100A6水平与临床病理学参数的相关性

2.4 影响胆管细胞癌患者血清S100A6高水平的多因素Logistic回归分析 多因素Logistic回归分析结果显示，肿瘤浸润深、淋巴结转移、TNM分期和肿瘤细胞分化差是胆管细胞癌患者血清S100A6高水平的危险性因素（P＜0.05，表 4）。

表4 影响胆管细胞癌患者血清S100A6高水平的多因素Logistic回归分析

3 讨论

S100A6又称为钙周期蛋白，是S100蛋白家族中核心成员之一。该蛋白具有两个EF手型结构(螺旋-环-螺旋钙结合域)，其羧基端与钙离子具有较高的亲和性。当与钙离子结合后，EF手型经典区暴露，进而与相应的靶蛋白作用，发挥其生物学效应。它在肿瘤中的异常表达可通过各种基因调控及信号通路途径对胃癌、胰腺癌、肝癌、胆管癌、结肠癌等肿瘤的生长、增殖、入侵和转移起重要作用。该蛋白有可能成为临床上新的肿瘤诊断分子标志物[9-11]。

目前，国内外关于S100A6与胆管细胞癌相互作用以及对胆管细胞癌患者术后预后影响的研究相对较少。Kim et al研究团队通过微分斑点杂交和Northern blot分析发现，S100A6在肝内肿瘤组织表达上调。相比于肝细胞癌，胆管细胞癌S100A6 mRNA水平显著增加，且免疫组织化学检测发现77.8%胆管癌组织染色阳性，10%原发性肝癌阳性，研究结果提示S100A6或许可用来区分胆管细胞癌与肝细胞癌[12]。Sato团队为研究S100A6蛋白在胆管癌组织表达的临床和病理学意义，进行了较为深入的研究，结果发现胆管癌形成可诱导S100A6蛋白的表达，且S100A4、S100A6、S100P在细胞质和细胞核内的表达与临床病理因素 (淋巴结转移和临床分期)无相关[13]。有研究用提取自鱼藤芏的橙桑黄酮治疗胆管癌并对癌细胞进行蛋白质组学分析，结果发现S100A6蛋白表达上调，提示S100A6可能对胆管细胞癌细胞具有抑制作用[14]。本研究结果显示，癌旁组织、肝组织、胆管细胞癌组织S100A6蛋白阳性表达率分别为20%、30%、65%，三者间差异有统计学意义。胆管细胞癌组织S100A6 mRNA和蛋白相对表达量高于癌旁组织或肝组织，或许提示血清S100A6高水平有助于胆管细胞癌的诊断。胆管细胞癌患者血清S100A6水平显著高于对照组。

除了胆管细胞癌，S100A6与胃癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌等也密切相关。之前有报道指出，通过shRNA表达载体途径可在食管癌Eca109细胞有效沉默S100A6基因，并进一步抑制该细胞的增殖活性及迁移能力[7]。也有研究表明，膀胱癌、汗腺肿瘤和子宫内膜异位症患者血清S100A6呈高水平。Duan研究团队发现，在结直肠癌，S100A6可通过影响MAPK通路促进癌细胞的增殖、分化和转移[8]。在肝细胞癌中也存在着S100A6基因的过度表达，并且推断其通过PI3K/Akt信号通路及与β-钙黏素有关的机制对肝癌发生发展起重要作用[15]。本研究发现，胆管癌患者血清S100A6水平与与CEA、CRP、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、肿瘤分化程度呈正相关，多因素Logistic回归分析结果显示，浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、分化程度是肿瘤患者血清S100A6高水平的危险因素。基于上述研究和先前的文献报道，我们推断S100A6或许可通过β-catenin蛋白、PI3K/Akt信号通路或MAPK信号通路上调，增强了肿瘤细胞的侵犯性表型和恶性行为，并严重影响胆管癌患者术后的预后。本研究与马亮等人的研究结论类似，他们证实S100A6蛋白表达与胃癌的肿瘤大小、浸润深度、淋巴管和静脉侵犯、淋巴结转移、肿瘤TNM分期等呈正相关，高中度S100A6基因表达的患者累积生存率明显低于不表达的患者，并指出肿瘤的浸润深度、淋巴管及静脉浸润、淋巴结转移、TNM分期以及S100A6高表达均为胃癌患者预后的独立危险因素[16]。有研究指出，S100A6与胆管癌患者各实验室指标无相关性，但与临床病理学参数有较高的相关性，同样指出血清S100A6水平高不利于胆管癌患者术后生存[17]。

本研究发现胆管癌患者肝组织和血清S100A6水平高，其意义还有待于进一步研究。