响应面法优化酸甘蓝发酵条件

2018-07-17董静姚妙爱

中国调味品 2018年7期

董静，姚妙爱

（江苏财经职业技术学院，江苏淮安 223003）

酸甘蓝作为一种传统的发酵蔬菜腌制品，其酸香味鲜，口感脆爽，不仅可以直接食用，还可用于制作美味的渍菜粉、酸菜汤。具有开胃除腻，增进食欲，帮助消化的功效，能够促进人体对铁等矿质元素的吸收，并且其发酵和生产过程简单，人们对此都津津乐道［1，2］。酸甘蓝主要是通过乳酸发酵而成，不仅保留了VC、氨基酸、有机酸以及膳食纤维等原料原有的营养成分，还含有乳酸菌等功能性微生物［3］，随着人们进一步揭示了乳酸菌对人体健康有益作用的机理，酸菜生产与加工引起了国内外的高度重视。

随着微生物技术的发展，酸甘蓝工艺有了不同程度的改变，对发酵剂、食盐浓度进行了大量的研究，Elena Peas等研究发现酸甘蓝质量好和生物胺含量最低的最佳发酵条件是肠膜明串珠菌和0.5%食盐浓度［4］。韩国玲等提出发酵剂5%乳酸菌纯培养物［5］，发酵温度20～25℃，发酵时间20天条件下发酵的酸白菜在感官指标上有明显改善；祝战斌等认为采用卤汁食盐质量分数为2.25%［6］，白糖质量分数为5%，发酵温度为22℃，发酵接种量为1%的自然发酵结合人工接种发酵甘蓝泡菜具备自然发酵风味好、人工接种时间快的优点。

由于酸甘蓝发酵过程中会产生亚硝酸盐，令许多消费者望而生畏，我国卫生标准规定，酱腌菜中亚硝酸盐含量不得超过20mg/kg，降低酸甘蓝中亚硝酸盐的含量是其工业化生产必须要解决的问题。本研究以酸甘蓝的感官指标、营养指标、安全指标、生产周期等综合评价为指标值，研究了适宜于工业化实施的食盐添加量、接种量、发酵温度等发酵条件对酸甘蓝综合品质的影响并对其发酵条件进行了优化，这将对酸甘蓝工业化、标准化、规模化生产具有重要的指导意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料

结球甘蓝（包菜）：购于淮安农贸市场；

植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）：辽宁省农业科学院微生物实验室提供；

泡菜盐：江苏省盐宝盐业有限公司。

1.1.2 试剂

碳酸氢钠、抗坏血酸、乙酸锌、冰醋酸、亚铁氰化钾、硼酸钠、盐酸、对氨基苯磺酸、亚硝酸钠、盐酸萘乙二胺、硝酸钠、氨水、草酸、2，6－二氯靛酚、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、乙酸钠、柠檬酸二胺、硫酸镁、硫酸锰、吐温80、磷酸氢二钾、琼脂（均为国药分析纯）。

MRS液体试管培养基：蛋白胨1.0g，葡萄糖5.0g，牛肉膏1.0g，酵母膏0.5g，乙酸钠0.5g，硫酸锰0.025g，柠檬酸二胺0.2g，硫酸镁0.02g，吐温80 0.1g，磷酸氢二钾0.2g，加蒸馏水至100mL，pH 6.2～6.4，121℃，15～20min灭菌［7］。

MRS固体试管培养基：在MRS液体培养基基础上加琼脂2g。

1.2 仪器与设备

DZQ400－2D真空包装机昆山康佳包装机械有限公司；SW－CJ－2F超净工作台苏州净化设备有限公司；LDZX－50FA灭菌锅、LHS－150SC电热恒温培养箱上海一恒科学仪器有限公司；PHS－3C酸度计上海世义精密仪器有限公司；FA1004电子天平上海精密科学仪器有限公司；S22PC可见分光光度计上海棱光技术有限公司；HH－D4型数显恒温水浴锅金坛市双捷实验仪器厂；组织捣碎机：HR2095飞利浦搅拌机飞利浦（中国）投资有限公司；50L双层内盖塑料桶山东庆云普利塑料制品销售中心。

1.3 方法

1.3.1 酸甘蓝加工工艺

1.3.1.1 酸甘蓝加工工艺流程

1.3.1.2 发酵剂的制备

固体试管菌种活化：将本实验室筛选后保存在冰箱中的固体菌种穿刺接种到固体MRS试管培养基中，在37℃下培养24h，得活化菌种。

液体试管菌种制备：将培养好的固体试管中的菌种接种到盛有5mL液体MRS培养基的20mm×200mm试管中，混匀后放入恒温培养箱中37℃下培养24h。

液体培养瓶菌种制备：将培养好的液体试管中的菌种按2%（V/V）接种到盛有1L液体MRS培养基的1L培养瓶中，混匀后放入恒温培养箱中37℃下培养24h。

种子罐菌种制备：甘蓝经整理、清洗，纵向切开，装满5L泡菜坛，按2%接入培养好的液体培养瓶中菌种，加入1%（W/V罐）食盐水溶液灌满，于30℃培养，发酵期间保持菜在发酵水以下，直至发酵水pH达到3.5。

1.3.1.3 加工操作要点

甘蓝挑选、修整、清洗：挑选新鲜、成熟、无病虫害的甘蓝，除去外叶、老叶，挖掉根芯，清洗干净。

装罐、发酵：将清洗干净的甘蓝装满50L发酵桶，1层菜1层盐，接入种子罐菌种，菌种分3次添加，装满后用木板压盖，加入自来水将发酵桶灌满，菜在液面以下，在发酵液表面盖上塑料薄膜，保持厌氧发酵。

切丝：将发酵好的甘蓝放入切菜机将酸甘蓝切成1.5～2mm宽的细丝［8］。

包装：将发酵好的甘蓝丝去除多余的水分，以每袋300g进行真空塑料包装。

1.3.2 酸甘蓝发酵终点判断

酸甘蓝pH值达到3.5以下，每袋装入酸甘蓝300g真空包装，置于30℃下培养2天不胀袋。

1.3.3 酸甘蓝感官品质评定方法

由10人组成品评小组，按照评分标准表，通过感官评价酸甘蓝产品的色泽、香气、质地和滋味，并做好记录，以感官综合评分判定产品的感官品质［9］，色泽满分25、香气满分25、滋味满分25、质地满分25，具体评分标准见表1。

表1 酸甘蓝感官品质评价标准Table 1Criteria for sensory evaluation of sauerkraut

1.3.4 酸甘蓝综合品质统计方法

综合品质的统计分析采用模糊综合评判法［10］，以感官评分（u1）、亚硝酸盐含量（u2）、酸度pH（u3）、维生素C含量（u4）、发酵时间（u5）作为评价因素，评价因素U＝｛u1，u2，u3，u4，u5｝建立评价因素隶属函数，以各因素在不同处理间的最大值为基准，即max＝｛ui1，ui2，ui3，ui4，ui5｝＝uib，通过隶属函数得出U的模糊矩阵因素值具有均一可比性。权重系数根据各因素的重要性来给定，本文的权重系数中感官品质0.4，亚硝酸盐含量0.2，pH 值0.1，维生素C含量0.2，发酵时间0.1，所有权数之和为1。权重系数矩阵 M＝（0.4，0.2，0.1，0.2，0.1），评价结果为V＝MR，根据V的大小来判断综合品质的相应优劣。其中亚硝酸盐含量的数值越小，对人体的危害越小，综合品质越高；pH值越低说明酸甘蓝酸味越浓，综合品质越高；发酵时间越短，生产效率越高，综合品质越高。因此，为了品质优劣的一致性，将亚硝酸盐含量、pH值、发酵时间的数值颠倒，亚硝酸盐含量、pH值、发酵时间的隶属函数为

1.3.5 单因素试验

在发酵罐中按照1%（W 盐∶V罐）食盐、2%（V菌种∶V罐）接种，30℃发酵，直至发酵结束，评定酸甘蓝的感官品质，测定酸甘蓝中维生素C、亚硝酸盐含量，测定pH值，记录发酵时间。分别考察食盐添加量（0，0.5%，1%，2%，3%）、接种量（0，0.5%，1%，2%，5%，10%）、发酵温度（10，15，20，25，30 ℃）对酸甘蓝综合品质的影响，平行3次试验，取平均值。

1.3.6 响应面分析法

确定影响酸甘蓝发酵的关键因素后，用Design Expert软件（Vision 7.1.3，Stat－Ease.Inc.，Minneapolis，MN.USA）设计试验，采用Box－Behnken法，以确定最优发酵条件。本文在单因素试验基础上，以食盐添加量、接种量、发酵温度3个因素为自变量，以酸甘蓝综合品质评价V值为响应值，设计三因素三水平试验，共计17个试验点，通过试验数据的二次回归拟合分析得到各因素与响应值间的回归方程，分析各因素与响应值间的主效应、因素间的交互效应得到最佳响应值，最终确定酸甘蓝发酵的最佳发酵条件，因素水平选取见表2。

表2 响应面因素与水平Table 2Factors and levels of response surface

1.3.7 检测方法

维生素C含量的测定：采用GB/T 6195－1986的2，6－二氯靛酚滴定法。

亚硝酸盐含量的测定：采用 GB 5009.33－2010的盐酸萘乙二胺法。

pH值的测定：采用pH计法，将酸甘蓝榨汁，使用精密pH计测定汁液的pH值。

2 结果与分析

2.1 食盐添加量对酸甘蓝综合品质的影响

在其他因素相同的条件下，加盐量不同可以控制微生物生长及它们在食品发酵过程中的活动［11］；适宜的食盐浓度不仅可以抑制有害菌的生长，增加保质期，具有防腐作用，还可以增加食品的独特风味。甘蓝在腌制时分别加入不同量的食盐，最终产品的感官评分、亚硝酸盐含量、pH值、Vc含量及综合品质见表3。

表3 不同食盐添加量下酸甘蓝各品质指标测定值及综合品质Table 3Quality indexes values and comprehensive quality of sauerkraut at different salt content

由表3可知，食盐的添加量为0.5%时，酸甘蓝的感官品质评分最高，Vc保存最好；食盐的添加量为1%时，酸甘蓝的感官品质评分较高，亚硝酸盐含量最低，酸度最低，发酵时间最短。食盐的添加量在1%时，酸甘蓝的综合评价值为0.725，综合品质最好。因此，选用食盐添加量1%作为较优添加量。

2.2 接种量对酸甘蓝综合品质的影响

在发酵开始时接入大量的乳酸菌，可以迅速地生长繁殖，并且抑制杂菌的生长，促使乳酸发酵的进行［12］，适宜的接种量，可促使乳酸菌快速地繁殖，促进酸甘蓝风味形成。甘蓝在腌制时分别接入不同的接种量，最终产品的感官评分、亚硝酸盐含量、pH值、Vc含量及综合品质见表4。

表4 不同接种量下酸甘蓝各品质指标测定值及综合品质Table 4Quality indexes values and comprehensive quality of sauerkraut at different inoculum size

由表4可知，当接种量为2%，5%时产品感官品质评分高，亚硝酸盐含量低，pH较低，VC保存较好，发酵时间较短；当接种量为10%时Vc含量最高，发酵时间最短。发酵剂接种量为5%时，酸甘蓝的综合品质评估值为0.750，综合品质最好，这与韩国玲以感官质量为指标值，确定的最佳接种量一致。因此，选择发酵剂5%作为较优添加量。

2.3 发酵温度对酸甘蓝综合品质的影响

酸甘蓝的发酵主要是以乳酸发酵为主，其中的乳酸菌属于中温微生物，发酵温度影响甘蓝发酵时间和产品的最终酸度，分别测定不同发酵温度下酸甘蓝的感官评分、亚硝酸盐含量、pH值、Vc含量、发酵时间和综合品质，结果见表5。

表5 不同发酵温度下酸甘蓝的各品质指标值及综合品质Table 5Quality indexes values and comprehensive quality of sauerkraut at different fermentation temperatures

由表5可知，随着发酵温度的升高，亚硝酸盐含量降低，Vc保存率升高，发酵周期缩短，生产成本降低。在20℃下发酵，酸甘蓝的感官品质最好，酸度最低；在30℃下发酵，亚硝酸盐含量最低，VC含量最高，发酵时间最短。当发酵温度为25℃时，酸甘蓝的综合品质评估值为0.835，综合品质最佳。贾树彪认为在较低温度下发酵效果较好，对发酵过程的起动与产品风味的形成有重要的作用，但发酵温度过低，发酵时间长，生产成本高，VC保存率低。发酵温度过高，发酵过程中极易引起杂菌的生长，引起酸甘蓝腐烂变质、变色、变味，导致发酵管理困难。在不同的温度下发酵甘蓝，发酵结束时，酸甘蓝中亚硝酸盐的含量均远低于国家标准，食用安全。因此，选择25℃作为较优发酵温度。

2.4 响应面法优化酸甘蓝发酵工艺

2.4.1 二次回归拟合及方差分析

利用Design－Expert统计分析软件对响应面优化试验方案与结果，见表6。

表6 Box－Behnken试验设计与结果Table 6Experimental design and results of Box－Behnken

利用 Design Expert 7.1.3软件对表6试验数据进行二次多项回归拟合，获得酸甘蓝的综合品质评价V对加盐量、接种量以及发酵温度的二次多项回归方程：

V＝0.84－8.858E－003A ＋4.812E－004B＋0.071C＋0.026AB－3.534E－003AC＋0.018BC－0.072A2－0.048B2－0.15C2，对此回归模型进行方差分析，结果见表7。

表7 方差分析表Table 7Results of regression analysis

由表7可知，该回归模型P＜0.0001，表明该模型极显著，能解释酸甘蓝综合评价值的变化。各因素的一次项C为极显著，二次项A2和B2为显著，C2均为极显著，交互项AB和BC为显著，且失拟项不显著，表明该模型与实际情况拟合很好，可用于预测酸甘蓝的综合品质。线性方程的相关系数R2＝0.9881，校正系数 R2＝0.9729，信噪比（Adeq Precision）＝22.077远大于4，表明该模型的准确性、适用性较好，预测值与实际值拟合好，能够很好用于酸甘蓝综合品质评价的分析和预测。由F值大小可知，影响酸甘蓝综合品质的因素主次顺序为C＞A＞B，即发酵温度＞食盐添加量＞接种量。

2.4.2 试验结果分析与优化

利用Design Expert软件对表6中数据进行二次多元回归拟合得到的二次回归方程的响应面及其等高线见图1～图3。

图1 食盐添加量与接种量交互作用的响应面和等高线Fig.1The response surface and contour of the interaction between salt content and inculum size

由图1可知，当发酵温度一定时，食盐添加量与接种量两个因素之间交互作用显著，食盐添加量在高水平时，酸甘蓝综合品质的响应抛物曲线的最高点也处在较低水平，而随着食盐添加量的下降，酸甘蓝综合品质的响应抛物曲线的最高点向高水平方向移动。当接种量一定时，随着食盐添加量的增加，酸甘蓝综合品质先升高后降低，说明在低浓度食盐时有利于接种乳酸发酵，盐浓度过大增大反而抑制乳酸菌的生长。

图2 食盐添加量与发酵温度交互作用的响应面和等高线Fig.2The response surface and contour of the interaction between salt content and fermentation temperature

由图2可知，当接种量一定时，食盐添加量与发酵温度的交互作用不显著。当食盐添加量一定时，发酵温度在20～25℃，随着发酵温度的升高，酸甘蓝的综合品质升高。发酵温度在25～30℃，发酵温度影响不显著，随着温度的升高，酸甘蓝的综合品质降低，因为此温度范围为乳酸菌的适宜温度，发酵快、时间短；但温度过高，也易引起腐败细菌、霉菌等有害微生物的生长，菜色泽变暗，风味变差。