富血小板纤维蛋白(PRF)促进骨再生的研究进展

张　斌，王　信，敖　俊

(1.遵义医学院附属医院 骨外科，贵州 遵义　563099；2.贵州省骨科医院 骨外科，贵州 贵阳　550002)

大节段的骨组织缺损是临床骨科医师面临的一大难题[1]。临床实践中治疗骨缺损主要应用骨移植技术，移植物的理想材料是自体骨，但自体骨有骨量少和取骨处并发症等缺点[2]。随着医学技术发展，骨水泥材料和人工骨移植技术已经较为广泛地应用于临床，但至今仍存在一些问题。例如，骨水泥存在生物相容性差，可吸收性差，成形过程放热大，体内成形固化速率慢，柔韧度较差等弊端[3-4]；人工骨移植存在来源限制与排斥反应等问题[5]。此时，骨组织工程让我们看到曙光，有望最终解决这个问题[6-9]。

近年来的研究显示富血小板纤维蛋白(Platelet-rich fibrin,PRF)对骨再生有促进作用[10-12]。PRF作为第二代血小板浓聚物(Platelet concentrates,PC)，来源于自体外周血液，制作过程无生物或化学制剂，自体移植生物安全性得到保证[13]。本文将对PRF的主要制备方法、分类及细胞因子(Cytokine,CK)的释放、粘附到成骨作用综述如下。

1　PRF主要分类、特点及制备方法

PRF由Choukroun等[13]首先提出，之后称之为Choukroun’s PRF或L-PRF(Leucocyte- and platelet-rich fibrin)，其制备过程不需要加入任何抗凝剂和凝血酶。方法如下：取10 mL全血(来源于人外周静脉)，立即以3000 rpm离心10 min。离心后上层为贫血小板血浆(Platelet-poor plasma,PPP)，底层为红细胞(Red blood cells,RBCs)，两层之间的白色絮状物则是L-PRF。离心后凝血酶和凝血因子主要分布于上层血清中，待其自然沉降至中层，则可使L-PRF中的纤维蛋白原激活并聚合，形成L-PRF凝块[14](见图1)。研究证实，L-PRF对多种组织有明显修复、再生作用，被广泛引用于骨科、口腔科、颌面外科等学科的手术中[15-17]。由于L-PRF中含有大量白细胞，所以它对局部还有抗感染作用[18]。

Ghanaati和Choukroun等[19]在原有的L-PRF的基础上改良并研制出A-PRF(Advanced platelet-rich fibrin)，其制作方法为：10 mL全血(来源于人外周静脉)，无菌条件下以1500 rpm离心14 min完成制作。A-PRF中的嗜中性粒细胞较L-PRF多，更能刺激单核细胞向巨噬细胞转化，释放更多生长因子(Growth factors,GFs)，有利于骨和软组织再生，是目前临床应用的一个主要方向。

i-PRF(Injectable platelet-rich fibrin)是一种液态状的PRF。其制备方法是：10 mL全血，在不加入任何抗凝剂的情况下，通过双重离心机以700 rpm离心3 min，取上中层血浆1 mL即得i-PRF[20]。得益于i-PRF的液态属性，使得它能更好地与其他外科植入物充分混合，如植骨颗粒，从而促进软组织和硬组织的愈合[21]。

上层为贫血小板血浆(PPP)；底层为红细胞(RBCs)；两层之间则是富血小板纤维蛋白(L-PRF)。　　图1　兔静脉全血5 mL在3 000 rpm离心10 min的条件下制作L-PRF

Ly-PRF(Lyophilized platelet-rich fibrin)是指冷冻的PRF。与新鲜L-PRF相比，其体积大，能长时间保存其内GFs的活性和数量，并且可以促进干细胞迁移。Ly-PRF的制作方法：10 mL全血，按照L-PRF制作方法制得新鲜L-PRF膜，将其装于冷藏瓶中，放于4 ℃冰箱中30 min，然后存放于-80 ℃冰箱中冷藏，之后于-51 ℃冷冻干燥机中过夜即制得。Ly-PRF可以在颅面骨再生和矿化组织再生中作为生物支架使用，提升L-PRF的成骨潜力[22]。

2　PRF中所含CK

PRF中含有许多可溶性CK，其中包括促炎性反应因子、抗炎性反应因子和GFs，这些可溶性CK是炎症反应和组织愈合过程的重要媒介[23]。

2.1PRF的抗感染作用及主要促炎性反应因子促炎性反应因子中起主要作用的是白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)。

IL-1β是炎性反应主要的调控因子之一，它主要由巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞、朗汉斯巨细胞等分泌[24-25]。其可调控破骨细胞，与TNF-α联合时可以促进骨溶解，抑制成骨[26]。Wang等[27]发现，在鼠骨延迟愈合模型中IL-1β明显增高。而高浓度的IL-1β能直接促进致密的纤维凝块形成，从而阻碍骨缺损的愈合进程[28]。

IL-6可以刺激B淋巴细胞分化，促使抗体分泌，并且可以增加CD4+和CD8+T淋巴细胞表达，与TNF-α和IL-1β协同抗感染[29]。作为免疫循环调控点之一，IL-6的分泌与IL-1β、TNF-α、血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)、细菌内毒素的刺激有关，并且受IL-6自身调控，起到激活和抑制自身的作用[30]。IL-6可以抑制破骨细胞的成熟、分化，从而使骨溶解减少，有利于减少原有骨细胞和新生骨细胞的丢失[31]。也有研究发现，大鼠骨折后体内IL-6增高，通过阻断IL-6受体，可以使成骨细胞特异性基因表达上调而促进成骨[32]。

TNF-α由巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞等分泌，是免疫反应中首先被释放，它可以刺激成纤维细胞生长和塑形[33-35]。TNF-α与IL-1β和IL-6同在一个调控循环中，它是刺激IL-1β和IL-6分泌的重要因子[30]。当骨折发生后，体内TNF-α分泌增加[32]，而TNF-α增加可以降低成骨细胞的存活率[36]。

上述各类型的PRF均含有大量白细胞，这是PRF抗感染作用的重要因素[19,37]。

2.2抗炎性反应因子抗炎性反应因子主要包括白介素-1Ra(Interleukin-1Ra,IL-1Ra)、白介素-4(Interleukin-4,IL-4)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)和转化生长因子-β1(Transforming growth factor -β1,TGF-β1)。

IL-1Ra在与IL-1同样的刺激因素下合成、释放，与IL-1形成拮抗[38]。IL-1Ra在早期巨噬细胞中释放较多，在晚期巨噬细胞中释放较少，当IL-1Ra释放量少时可能会延迟骨折愈合[39]。

IL-4主要由TH2 CD4+T细胞分泌。IL-4通过增加B细胞和T细胞之间的相互作用促进体液免疫。IL-4抗炎性反应作用表现在与IL-1β、TNF-α、前列腺素(Prostaglandin,PG)的产物拮抗，从而减少细胞对干扰素-γ(Interferon-γ,INF-γ)和内毒素的应答[40]。在不同阶段，T细胞可以分泌3种不同状态的IL-4产物，包括：原始状态、激活状态/记忆状态、效应状态/记忆状态，以此调节炎性反应[41]。研究发现，鼠体内骨量增加时IL-4明显增高，而骨量减少时IL-4相对较低[42]。

IL-10由T细胞、B细胞、NK细胞等分泌，通过抑制INF-γ、TNF-α的炎性产物起到抗炎作用，帮助骨愈合[43]。

TGF-β1在内环境中维持免疫应答和防止自身不良免疫应答[44]，抵消和平衡炎性反应所导致的不良反应，其对肿瘤也有一定的防御作用[40]。

2.3GFs释放、粘附和成骨作用GFs中起明显作用的是TGF-β1、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、PDGF、胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor,IGF)。这些因子在组织损伤后随着血液聚集到损伤部位，刺激血管、肉芽组织、骨组织等生成来修复损伤[45]。

TGF-β1主要作用是通过成纤维细胞或成骨细胞合成Ⅰ型胶原蛋白和纤维连接蛋白[46]，使细胞外基质重塑，促进骨折愈合[47-48]。反之，TGF-β1减少可能会导致骨延迟愈合或骨不连[49]。

VEGF主要作用是支持和协调血管等重要结构早期形成，直接调控血管内皮细胞迁移、增殖、分化和存活[50-51]，以及对成骨细胞分化起到刺激作用，是骨修复中的重要GFs之一[52]。

PDGF主要作用是调节干细胞系迁移、增殖、存活，在疤痕形成和组织塑形过程中起到重要作用[53-54]。PDGF还是成骨细胞趋化和有丝分裂的激动因子，可以促进成骨[55]。

IGF能够促进所有细胞增殖和分化，其中也包括肿瘤细胞[56]。有研究表明IGF-1能够促进内皮细胞迁移、存活，促进管状结构形成，以及对抗内皮损伤[57]。IGF-1是骨骼中含量最高的GF，它可以通过内分泌、旁分泌和自分泌机制调节生长素(Growth hormone，GH)和甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone,PTH)来促进成骨[58]。

有研究发现，L-PRF中含有大量TGF-β1和PDGFs，L-PRF中TGF-β1的含量约为普通血清的1.39倍；PDGFs的含量约为普通血清的1.68倍[59]。Dohan[60]等通过体外实验发现，L-PRF能在至少7 d内大量持续释放3种主要GFs(TGF-β1,PDGF,VEGF)和1种重要的基质细胞凝固糖蛋白——血小板反应蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP-1)，他们认为L-PRF中有大量因子的重要因素是白细胞将这些因子锁在纤维基质中。Su[61]等研究发现，L-PRF中所含的GFs在300 min时释放量最大，并且发现在300 min时PPP中也含有大量稳定的GFs，他们建议L-PRF制作完成后应立即植入体内。Schar[62]等发现，L-PRF与富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)、血凝块相比，L-PRF中TGF-1含量最高，释放峰值在第7天；IGF-1和PDGF-AB的总含量无区别，IGF-1在前3 d内缓慢释放，PDGF-AB则是逐渐释放；VEGF的释放峰值同样出现在第7天。为研究L-PRF制作条件对GFs的影响，Eren等[63]发现离心时间对GFs(VEGF除外)无影响，离心12 min时VEGF可能对组织愈合较好，并且能在72 h达到峰值。

Masuki等[64]，通过对比研究发现，TGF-β1在A-PRF中的含量与在浓缩生长因子(Concentrated growth factors,CGF)中的含量无差异，但是明显高于PRP中的含量；虽然PDGF-BB在A-PRF中含量的平均值稍低于CGF中含量的平均值，但无统计学差异，而两者均明显高于PRP中PDGF-BB含量的平均值；VEGF在A-PRF中含量的平均值稍高于在CGF中含量的平均值，但无统计学差异，两者所含VEGF的量也均明显高于PRP中所含的量。Kobayashi等[65]研究发现，A-PRF在10天内释放GFs和蛋白的总量高于L-PRF。

Miron等[66]的研究发现，i-PRF在10 d内大量释放GFs，其中PDGF-AB、PDGF-BB、IGF-1的总量均高于在PRP中的总量。Choukroun等[67]认为，i-PRF通过低速离心，能够使更多白细胞、血小板和GFs粘附在其内部的纤维上，但其对于细胞的影响和组织愈合作用有待进一步研究。

Zhang[68]等发现PDGF-BB、TGF-β1在Ly-PRF和新鲜L-PRF中的含量无明显差异，即使在-196℃冷藏后也不会影响生物因子的表达。

3　PRF骨再生研究

3.1PRF治疗骨缺损许多研究表明PRF有成骨作用之后，PRF也因此被应用于临床上治疗骨缺损。口腔颌面外科率先将L-PRF应用于牙周骨缺损、口腔骨囊肿术后骨缺损、牙槽骨缺损、上下颌骨缺损等治疗并取得了满意的疗效。在口腔中L-PRF膜不仅可以使骨缺损处与口腔隔开，早期形成软组织愈合，而且还能显著地加速骨修复[69-74]。

3.2PRF联合间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)促进成骨作用MSCs是再生医学的重要研究方向之一，不少学者将L-PRF和MSCs搭配，进行骨再生研究。Dohan等[75]将人的骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)与L-PRF在体外共培养，发现L-PRF对BMSCs的增殖和分化都有促进作用，分化作用与L-PRF的剂量有关，同时发现L-PRF与BMSCs共培养可有很多矿化点出现。另一方面，研究表明L-PRF能够促进脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived stem cells,ADSCs)迁移、增殖和分化，促进血管生成，可以治疗鼠急性心肌梗死模型[76-77]，而且还有异位成骨作用[78]。Zhou等[79]用BMSC-PRF复合物，经过12周成功对兔下颌骨缺损修复。Wang等[80]以Hydroxyapatite-BMSC-PRF复合物治疗兔颅骨15mm标准骨缺损取得满意疗效。L-PRF与MSCs复合物被用于临床也取得满意的疗效，Dallari等[81]以BMSC-PRF复合物治疗人股骨或胫骨骨不连病例，他们认为BMSC-PRF复合物配合标准外科治疗，可以缩短骨不连愈合的时间，使患者早期活动，减少并发症发生以及降低治疗费用。

3.3PRF联合植入材料治疗骨缺损对于临床骨科中骨缺损治疗，常常需要植入物具备一定生物力学强度，单纯植入PRF、细胞-PRF混合物对局部力学支撑不足。即便Ly-PRF为固态，具有一定力学强度[22,68,82]，但植入后的力学强度变化与植入时间的关系鲜有报道。Choukroun等[83]在提出PRF早期就研究了L-PRF对同种异体骨在鼻窦增高术中骨成熟的影响，他们发现L-PRF能够促进骨愈合，并从组织学观察，L-PRF与同种异体骨联合植骨，至少可减少4个月的愈合时间。Kim等[84]将PRF-三磷酸钙(Tricalcium phosphate,TCP)、单纯TCP和人重组骨形态发生蛋白2(Recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP2)-TCP分为3组分别植入到直径8 mm的兔上颌骨前窦壁骨缺损模型中进行对比实验，发现PRF-TCP组、rhBMP2-TCP组均可在第2周明显成骨、塑形及钙化，但经过8周比较，PRF-TCP成骨速度最快。Nacopoulos等[85]将L-PRF与羟基磷灰石、TCP复合，发现其可以为成骨提供更好的力学和结构支撑。Yoon等[86]将L-PRF与异种骨结合，治疗兔颅骨缺损，发现其不仅可以促进骨再生，而且还可以促进血管生成。Kokdere等[87]将L-PRF与自体骨颗粒混合治疗直径3 mm的兔胫骨骨缺损模型，发现L-PRF与自体骨混合植入，早期就可以促进新骨形成，并对骨愈合起到积极作用。Chandradas等[88]将L-PRF与去矿化骨基质混合，治疗牙周骨缺损取得满意疗效，通过影像学发现新生骨质填充缺损处。Song等[89]在低温下以纳米二磷酸钙-聚乙烯醇为材料打印3D生物支架，搭载L-PRF并种植BMSCs进行体外实验和动物实验，发现二磷酸钙-聚乙烯醇-PRF支架在体外比二磷酸钙-聚乙烯醇支架能使BMSCs更好地粘附、增殖和成骨分化；二磷酸钙-聚乙烯醇-PRF-BMSCs支架植入经典兔桡骨缺损模型中有大量成骨，且成骨量明显高于以二磷酸钙-聚乙烯醇-BMSCs支架组和二磷酸钙-聚乙烯醇-BMSCs未经打印直接植入组。

4　展望

PRF属于第二代PC，制作方法相对简单，制作过程中不需要加入任何生物、化学制剂[13]，能够稳定、大量释放GFs，GFs在300 min内出现释放高峰，约在7 d内大量释放，持续释放时间约10 d[60-61,65-66]。L-PRF、A-PRF、i-PRF、Ly-PRF中均含有大量白细胞，白细胞对局部有抗感染作用，并且能将GFs粘附在PRF基质中，还可以促进MSCs迁移、增殖、分化[19,37]，而这些GFs正是PRF能够促进干细胞迁移、增殖、分化的主要因素之一，并且PRF中所含纤维网可以对组织再生提供空间结构支持，对新血管生成、骨再生提供极大帮助[90]。

综上所述，PRF可制备成液态、凝胶和固态，无论哪种形态都能保持其中含有大量GFs，这对成骨有积极的促进作用。由于PRF的成分均源自于自体血液，当它被植入后，具有低免疫性、可完全吸收等优势，另外它还能与多种材料复合促进成骨[83-88]，是骨再生研究中的一种具有明显成骨作用、可塑性强、潜力巨大的自体生物材料。