无机盐种类与用量对AMEP蛋白表达水平的影响

万恒东 岳文涛 赵锋 商宪富 陈道文 王思文 孙明超 刘权

摘 要：AMEP蛋白是从枯草芽孢杆菌中分离鉴定出来的一种新型蛋白激发子，能够诱导植物防卫反应并提高植物的抗病性，是生物农药的理想候选。在前期的研究中发现，培养基中的无机盐对AMEP蛋白表达水平有很大影响。为了最大限度地提高AMEP蛋白的产量，通过在AMEP蛋白的发酵培养基中添加多种无机盐，研究不同种类的无机盐对AMEP蛋白表达水平的影响。结果表明，磷酸钙和磷酸氢二钠能显著提高AMEP蛋白的表达水平，而氯化钠、氯化钙、硫酸锌则显著降低了AMEP蛋白的表达水平。当磷酸钙用量为2g/L时，AMEP蛋白表达产量最高。

关键词：AMEP;无机盐;蛋白产量;磷酸钙;氯化钠

中图分类号 Q936  文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）18-0024-03

Effects of Inorganic Salts on the Expression of AMEP Protein

WAN Hendong1 et al.

（1Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing163300， China）

Abstract： AMEP protein is a new Protein Elicitor isolated from Bacillus subtilis. It can induce plant defense response and improve plant disease resistance. It is an ideal candidate for new biological pesticides. In the previous study， it was found that the inorganic salts in the medium had a great influence on the expression level of AMEP protein. In order to maximize the production of AMEP protein， the effects of different inorganic salts on the expression of AMEP protein were determined by adding a variety of inorganic salts to the culture medium of AMEP protein. The results showed that calcium phosphate and disodium hydrogen phosphate significantly increased the expression level of AMEP protein， while sodium chloride， calcium chloride and zinc sulfate significantly decreased the expression level of AMEP protein. It was found that the expression yield of AMEP protein was the highest when the dosage of calcium phosphate was 2g/L.

Key words： AMEP; Inorganic salt; Protein yield; Calcium phosphate; Sodium chloride

在我國，常采用施用化学农药的方式来防治农作物病害，以保障农作物的产量与质量。然而，大量施用化学农药不仅会破坏耕种土地的土壤生态环境，而且有害生物的抗药性也会因此而增强[1-2]，因此近年来生物农药的研究逐渐成为热点。蛋白激发子是来自于微生物的一类蛋白质，可与植物细胞表面相应的受体特异性结合，诱导植物发生防卫反应[3]，提高植物的抗病能力，被视为生物农药的理想候选。

AMEP蛋白是从芽孢杆菌中分离出来的一种新型蛋白激发子，包含76个氨基酸残基，其相对分子质量为8.36kDa[4]。现有研究表明，AMEP蛋白可以与植物相互作用并引起一系列的防卫反应，该蛋白兼具拮抗植物病原菌和杀伤有害昆虫的功能[5-6]，可将其用于生物防治来保障植物的健康生长，是蛋白类生物农药的理想材料[7]。

在AMEP蛋白的前期鉴定过程中，研究者分别使用LB培养基和YME培养基对枯草芽孢杆菌进行培养，结果显示，使用LB培养基进行培养时无法检测到AMEP的表达，而使用YME培养基进行培养时AMEP蛋白表达水平显著提升。经过比较，2个培养基的主要差别为YME培养基中不含有氯化钠，说明氯化钠抑制了蛋白表达。已有研究表明，培养基中无机盐的种类与用量会影响到微生物的发酵产量[8]，因而需要对培养基中无机盐的种类和用量进行深入，以提高AMEP蛋白的表达水平。

本研究以YME培养基为基础，添加不同种类的无机盐，探讨其对AMEP蛋白表达水平的影响，以确定最适无机盐的种类;并对最适无机盐的用量进行梯度优化，确定最适无机盐用量，旨在为提高AMEP蛋白的产量提供科学依据。

1 实验材料

本实验所用菌株为枯草芽孢杆菌BU412，由本实验室分离鉴定并保存于中国模式菌种收集中心（CCTCC M2016142），用于AMEP蛋白的表达。

YME培养基：麦芽糖10g/L、酵母提取物4g/L、葡萄糖4g/L、pH7.2，用于枯草芽孢杆菌BU412的菌株培养。低盐缓冲液：20mM Tris–HCl（PH7.5），高盐缓冲液：20mM Tris–HCl 1M NaCl（PH7.5），用于AMEP蛋白的纯化。

本次试验所用到的无机盐为氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸钙、硫酸锌、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，均为分析纯试剂。

2 实验方法

2.1 无机盐种类的筛选 挑取枯草芽孢杆菌BU412的单菌落进行接种至100mL的YME液体培养基中，在32°C、160r培养12h。按1∶100的比例，分别将3mL的种子液接入300mL的YME液体培养基中，共8瓶。这8瓶培养基中分别含有不同种类的无机盐，分别为氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸钙、硫酸锌、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，各无机盐的用量均为1g/L。随后对上述培养基进行培养，在32°C、160r条件下培养22h。

将培养完成的枯草芽孢杆菌BU412于4℃条件下16000g离心15min，获得培养液上清。将上清液通过0.22μM的滤膜过滤，用于蛋白质纯化。蛋白质纯化采用的是AKTA Purifier蛋白纯化仪，先用低盐缓冲液预平衡5ML的Hitrap Q hp的阴离子交换柱，之后将上清液上样加入阴离子交换柱上，流速为1mL/min。上样完成后，使用3倍柱体积的低盐缓冲液进行平衡，使用40%的高盐缓冲液进行洗脱，并收集蛋白样品。离子交换纯化后的蛋白经过截留体积为30kDa的超滤管进行进一步除杂，除去小分子量的杂蛋白，截留的蛋白样品即为AMEP蛋白。

使用紫外微量分光光度计Nanodrop对纯化后的AMEP蛋白进行浓度测定，经换算得到AMEP蛋白的表达产量。以AMEP蛋白的表达量为参考指标，筛选出最适无机盐的种类。

2.2 无机盐浓度的筛选 在确定最适的无机盐后，按2.1中所述的方法条件培养枯草芽孢杆菌，改变YME培养基中无机盐的浓度（0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L），在32°C、160rpm条件下培养22h，收集菌体。参照2.1所述方法分离纯化AMEP蛋白并检测蛋白浓度，得到AMEP蛋白的表达产量。以AMEP蛋白的表达量为参考指标，筛选出无机盐的最佳浓度。

3 结果与分析

3.1 无机盐种类对AMEP蛋白产量的影响 利用Origin 8.5对通过紫外微量分光光度计检测得到的AMEP蛋白表达产量进行数据分析并绘制方差柱形图。在使用不同的无机盐对BU412菌株培养的条件下，菌株发酵生产AMEP蛋白的表达水平如图1所示，磷酸钙和磷酸氢二钠能显著提高AMEP蛋白的表达水平;磷酸二氢钠和氯化钾的AMEP蛋白表达水平与空白对照组无显著差异;氯化钠、氯化钙、硫酸锌和氯化镁则显著降低AMEP蛋白表达水平。以上结果说明无机盐种类对AMEP蛋白产量影响较大，尤其是一些无机盐的存在会极大地限制AMEP蛋白的表达，今后在AMEP蛋白的表达过程中要注意避免使用此类无机盐。由于磷酸钙和磷酸氢二钠都会显著提高AMEP蛋白的表达水平，但由于两者相比，磷酸钙效果更加显著，因此确定最适无机盐为磷酸钙，后续的最适无机盐用量也在此基础上进行。

3.2 最适磷酸钙的用量 在确定磷酸钙为最适无机盐后，本文对培养基中磷酸钙的最适用量进行了筛选。经过蛋白纯化和浓度测定，制作柱形图，得到AMEP蛋白的表达水平如图2所示。由图2可知，磷酸钙的用量小于2g/L时，AMEP蛋白的表达量会随着磷酸钙用量的增加而升高;当磷酸钙的用量为2g/L时，AMEP蛋白表达量达到最大;而当磷酸钙的用量大于2g/L时，AMEP蛋白表达量会逐渐下降。由此确定，AMEP蛋白表达培养基中的磷酸钙最适用量为2g/L。

4 讨论

已有研究表明，菌株发酵除受到发酵条件的限制外，培养基的组成也是一个至关重要的影响因素[10]。无机盐是微生物生长和代谢不可或缺的重要营养成分[11]，其具有构成菌体细胞成分，作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂，调节培养基的渗透压、pH，氧化还原电位等作用。尽管微生物对于无机盐的需求量很少，但是在发酵过程中有可能会因为无机盐的种类以及无机盐的用量而不能满足菌体的生长以及代谢产物的要求，从而影响到微生物的发酵产量[12]。本次实验的目的是探究培养基中无机盐的种类及用量对AMEP蛋白表达产量的影响。

在添加的无機盐为磷酸钙时，AMEP蛋白的表达产量表现为最高;在添加的无机盐为氯化钾、磷酸氢二钠时，AMEP蛋白的表达产量与空白对照组相似;在添加的无机盐为氯化钠、硫酸锌、氯化钙和氯化镁时，AMEP蛋白的表达产量均显著低于空白对照组。值得注意的是，在培养基中加入氯化钠时，AMEP蛋白的表达量最低，解释了之前的研究中使用LB作为培养基进行发酵无法得到AMEP蛋白。这些结果说明不同种类的无机盐对AMEP蛋白表达产量的影响各不相同[13]，且用于发酵生产AMEP蛋白的最适无机盐为磷酸钙。

由相关研究可知，磷是微生物生长代谢活动中的重要元素，既参与了磷脂、核酸以及多种辅酶的构成，也在代谢调节方面发挥着重要作用。而在微生物发酵中钙离子主要参与细胞调节细胞的生理状态，具有降低细胞膜的通透性、维持细胞的胶体状态的作用[14]。磷酸钙可能在AMEP蛋白外分泌表达过程中的蛋白诱导表达信号通路和细胞膜通透方面起到了促进作用，在一定程度上解释了为何磷酸钙可以显著提高AMEP蛋白表达产量。

据相关研究表明，无机盐的用量表现为在适当浓度范围时，会提高蛋白的表达水平;当使用的无机盐用量不在此类无机盐用量的最适浓度范围内时，仍会对蛋白的表达水平产生影响，但影响的程度均会小于此类无机盐最适用量对蛋白表达水平的影响[15]。虽然磷酸钙对AMEP蛋白的表达具有促进作用，但其用量也不是越大越好，经实验确定最适用量为2g/L。此研究结果可为今后提高AMEP蛋白的表达水平提供参考。

5 结论

本研究通过探讨培养基中无机盐的种类及用量对AMEP蛋白表达水平的影响，最终确定了发酵生产AMEP蛋白的最适无机盐为磷酸钙，其最适用量为2g/L。这一结果将为最大限度地提高AMEP蛋白的表达水平以及将AMEP蛋白相关产品应用于植物病虫害防治提供了科学依据。

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（责编：张宏民）