Yes相关蛋白、p63和Bcl-2在弥漫大B细胞淋巴瘤的表达及意义

沈　艳，何新明，林喜娜，陈贵东，杨　通，古婉仪，顾　霞

(1.广州医科大学附属第二医院 病理科，广东 广州　511447；2.广州医科大学附属第一医院 病理科，广东 广州　510120)

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是淋巴瘤中最常见的一种类型，占所有非霍奇金淋巴瘤的30%～40%，中位发病年龄为60～70岁，在临床表现、组织形态和预后等方面具有高度的异质性。Hippo通路是一条在进化上十分保守的细胞信号转导通路，在调控细胞增殖、凋亡和分化过程中发挥着重要的作用[1]。Yes相关蛋白是Hippo通路的主要效应分子，具有转录共激活因子活性，Yes相关蛋白表达异常可使细胞异常增殖导致肿瘤的发生发展[2]。近年来Yes相关蛋白在实体肿瘤中的研究已成为热点，但在淋巴瘤中的表达和作用尚不清楚，国内尚未见相关研究报道。p63和BCL-2是凋亡调控的重要因子，与淋巴瘤的发病有关。本研究应用免疫组化技术对45例DLBCL和25例反应性增生淋巴组织(reactive hyperplasia of lymphoid tissue，RHL)中Yes相关蛋白、p63和Bcl-2蛋白的表达进行检测，旨在探讨其在DLBCL中表达的相互关系和临床病理意义。

1　材料与方法

1.1研究对象收集广州医科大学附属第一医院病理科2012～2017年经病理检查确诊为DLBCL的存档石蜡标本45例，入选病例由两名资深病理专家复读切片，对其组织学类型进行回顾性分析并确诊，诊断标准参照2016年WHO关于淋巴组织肿瘤分类[3]。其中，男27例，女18例，年龄20～89岁，平均年龄(63.9±14.3)岁；结内31例，结外14例。按CD10、BCL-6和MUM1的表达将DLBCL分为生发中心B细胞型(germinal center B cell-like，GCB)和非生发中心B细胞型(non-germinal center B cell-like ，non-GCB)两个亚型，其中GCB型9例，non-GCB36例。另选取25例RHL标本作为对照组。

1.2方法

1.2.1主要试剂浓缩型Yes相关蛋白鼠抗人单克隆抗体 (克隆号：GT256，浓度为1.68 mg/mL，)购自美国GeneTex公司，工作浓度按1∶800进行稀释。即用型p63和Bcl-2鼠抗人单克隆抗体为Dako公司产品，免疫组化GTVisionTMI/HRP试剂盒购自基因科技有限公司。

1.2.2Yes相关蛋白、p63和Bcl-2蛋白检测采用免疫组化GTVision二步法：石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS液浸泡5 min，加枸橼酸，微波抗原修复，中火，3 min×3次；自然冷却至室温；PBS液冲洗3 min×3次；3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性，孵育10 min；PBS液冲洗3 min×3次；滴加一抗，室温箱孵育60 min，PBS冲洗3 min×3次；滴二抗(GTVisionTMI型聚合物)，室温孵育30 min，PBS冲洗3 min×3次；DAB显色，自来水充分冲洗，苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。每批染色均设阳性对照和阴性对照。以已知阳性反应片做阳性对照，以PBS替代一抗做阴性对照。

1.2.3结果判断免疫组化染色阳性信号呈黄色或棕黄色颗粒。Yes相关蛋白主要定位于细胞浆，p63定位于细胞核，Bcl-2定位于细胞浆。Yes相关蛋白采用半定量方法判断结果[4]：① 按细胞染色强弱评分：0分，不着色；1分，浅黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色；② 根据阳性细胞所占百分比分为：0分，无阳性细胞； 1分，阳性细胞数<10%；2分，阳性细胞数10%～50%；3分，阳性细胞数>50%。按①②乘积判断结果：0为阴性，1～2为(+)，3～4为(++)，>4为(+++)。P63和Bcl-2按阳性百分比分级[5]：(-)，无阳性肿瘤细胞或阳性肿瘤细胞<30%；(+)，阳性肿瘤细胞≥30%。

1.3统计学处理实验数据用SPSS 17.0软件进行处理，组间率的比较用χ2检验，P<0.05(双尾值)为差异具有统计学意义。相关分析用行×列表资料的关联性检验方法检验，以P<0.05(双尾值)为二者相关，列联系数以Cp表示。

2　结果

2.1Yes相关蛋白在DLBCL和RHL中的表达Yes相关蛋白在DLBCL中的表达阳性率为60.0%，阳性标记细胞呈散在或弥漫分布；而在RHL中表达阳性率为100%，阳性标记细胞在滤泡区和滤泡间区各阶段淋巴细胞中呈弥漫分布，以滤泡生发中心表达强度最高。Yes相关蛋白在DLBCL和RHL之间表达差异有显著性(P<0.05，见表1，图1～3)。

表1Yes相关蛋白在DLBCL和RHL中的表达

组别例数Yes相关蛋白-++++++阳性率(%)PDLBCL4518191760.00.001RHL25001114100.0

呈弥漫阳性，SP×100。　　图1　Yes相关蛋白在DLBCL中表达

图2　Yes相关蛋白主要定位于细胞胞浆内(SP×200)

呈强阳性表达，阳性细胞弥漫分布在滤泡区和滤泡间区，SP×50。　　图3　Yes相关蛋在RHL中表达

2.2p63、Bcl-2在DLBCL和RHL中的表达p63和Bcl-2在DLBCL中的表达阳性率分别为44.4%和82.2%，且阳性细胞呈弥漫分布。在RHL中，p63的表达阳性率为0，而Bcl-2蛋白阳性细胞主要分布于套区和副皮质区，滤泡生发中心为阴性，均为正常表达模式，未见异常表达。p63、Bcl-2蛋白在DLBCL和RHL两组间表达差异具有统计学意义(P<0.05，见表2，图4～6)。

2.3Yes相关蛋白、p63和Bcl-2表达与DLBCL临床病理特征的关系Yes相关蛋白、p63和Bcl-2三指标的表达与患者性别、年龄、病变部位和免疫表型等临床病理参数均无相关性(P>0.05，见表3)。

表2p63、Bcl-2在DLBCL和RHL中的表达

组别例数p63阴性例数(%)阳性例数(%)PBcl-2∗阴性例数(%)阳性例数(%)PDLBCL4525(55.6)20(44.4)0.0008(17.8)37(82.2)0.000RHL25 25(100.0)0(0.0)25(100.0)0(0.0)

*Bcl-2在RHL中呈正常表达模式判读为阴性，呈异常表达模式判读为阳性。

图4　p63在DLBCL中表达呈弥漫阳性表达(SP×100)

呈正常表达模式，即阳性表达细胞主要分布于套区和副皮质区，滤泡生发中心为阴性，SP×50。　　图5　Bcl-2在RHL中表达

呈弥漫强阳性异常表达，SP×200。　　图6　Bcl-2在DLBCL中表达

2.4Yes相关蛋白、p63和Bcl-2表达在DLBCL中的相关性在DLBCL组织中，p63在Yes相关蛋白阴性组和Yes相关蛋白阳性组中的表达阳性率分别为38.9%(7/18)和48.1%(13/27)，差异无显著性(Cp=0.091，P>0.05)；Bcl-2在Yes相关蛋白阴性组和Yes相关蛋白阳性组中的表达阳性率分别为88.9%(16/18)和77.8%(21/27)，差异无显著性(Cp=0.141，P>0.05)。Bcl-2在p63蛋白阴性组和p63蛋白阳性组中表达阳性率分别为80%(20/25)和85%(17/20)，差异无统计学意义(Cp=0.166，P>0.05)；Yes相关蛋白、p63和Bcl-2三者表达之间无相关性(见表4～5)。

表3Yes相关蛋白、p63和Bcl-2表达与DLBCL各临床病理特征的关系

病理特征例数Yes相关蛋白阴性例数(%)阳性例数(%)PP63 阴性例数(%)阳性例数(%)PBcl-2阴性例数(%)阳性例数(%)P性别　男2710(37.0)17(63.0)0.61913(48.1)14(51.9)0.2213(11.1)24(88.9)0.301　女188(44.4)10(55.6)12(66.7)6(33.3)5(27.8)13(72.2)年龄　<60岁197(36.8)12(63.2)0.71210(52.6)9(47.4)0.7362(10.5)17(89.5)0.488　≥60岁2611(42.3)15(57.7)15(57.7)11(42.3)6(23.1)20(76.9)病变部位　结内3114(45.2)17(54.8)0.29316(51.6)15(48.4)0.4284(12.9)27(87.1)0.394　结外144(28.6)10(71.4)9(64.3)5(35.7)4(28.6)10(71.4)免疫分型　GCB93(33.3)6(66.7)0.9397(77.8)2(22.2)0.2611(11.1)8(88.9)0.922　non-GCB3615(41.7)21(58.3)18(50.0)18(50.0)7(19.4)29(80.6)

表4Yes相关蛋白与p63和Bcl-2在DLBCL中表达的相关性

Yes相关蛋白例数p63阴性例数(%)阳性例数(%)PBcl-2阴性例数(%)阳性例数(%)P阴性1811(61.1)7(38.9)0.5402(11.1)16(88.9)0.577阳性2714(51.9)13(48.1)6(22.2)21(77.8)

表5p63和Bcl-2在DLBCL中表达的相关性

p63例数Bcl-2阴性例数(%)阳性例数(%)P阴性255(20.0)20(80.0)0.540阳性203(15.0)17(85.0)

3　讨论

Yes相关蛋白是经典Hippo信号通路的主要效应因子。Hippo通路异常导致对Yes相关蛋白灭活失效和(或)Yes相关蛋白自身活性增强，可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，进而参与肿瘤的形成[6]。研究显示，Yes相关蛋白异常高表达与人类多种实体肿瘤发生发展密切相关，包括乳腺癌、恶性黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌等[7-12]，并与肿瘤的高侵袭性与不良预后有关，提示Yes相关蛋白可能在肿瘤中起着癌基因作用。但最近Barry等[13]和Tufail等[14]的研究结果分别显示Yes相关蛋白在结直肠癌和乳腺癌中呈低表达，而低表达的Yes相关蛋白可抑制肠干细胞再生，并与浸润性乳腺癌ER和/或PR阴性表达显著相关。这两项研究表明Yes相关蛋白在肿瘤进展中起着抑癌基因作用。鉴于诸多研究结果不一致、甚至相互矛盾，有学者提出Yes相关蛋白可能在肿瘤中扮演着抑癌基因和癌基因的双重角色。

近年来，随着研究的不断深入，Hippo通路在免疫系统的调控功能被证实，尤其在T细胞发育、分化、活化和迁移等方面发挥了重要作用[15]。然而，目前有关Hippo通路和Yes相关蛋白在B细胞发育和功能中的研究十分少见，尤其是在B细胞性淋巴瘤中的表达特点及其临床意义尚不十分清楚。为此，本研究从蛋白水平上对B细胞性淋巴瘤最常见类型—DLBCL中的Yes相关蛋白的表达情况进行了检测，并与良性淋巴组织中的表达进行对比分析。研究结果显示， Yes相关蛋白在良性淋巴组织中均呈中-高强度表达，提示Yes相关蛋白可能参与了成熟B细胞各阶段的分化。在DLBCL中，Yes相关蛋白的表达阳性率为60.0%，明显低于良性淋巴组织，提示Yes相关蛋白在DLBCL发生发展中可能起着抑癌基因的作用。值得一提的是，本研究中，良、恶性淋巴组织中Yes相关蛋白的表达均定位于细胞浆，由于在经典Hippo信号通路中活化的Yes相关蛋白作为转录共激活因子，通常情况下富集在细胞核内发挥作用，我们推测Yes相关蛋白很可能通过非经典Hippo信号通路参与了B细胞分化调控及抑制B细胞增殖和恶性转化，因为已有研究证实胞浆定位的Yes相关蛋白亦具有生物学活性，它能够通过与其他信号通路交互作用，从而抑制细胞增殖[16]。

p63基因是p53家族成员之一，定位于染色体3q27-29。其编码产物有两类异构体，即TAp63和△Np63，两者在功能上有明显差异，TAp63表达水平升高可以促进细胞凋亡，而△Np63的过度表达则可抑制细胞凋亡，具有癌基因功能[17]。有关p63蛋白在DLBCL中是起肿瘤抑制作用还是促进作用，目前学术界仍存在争议。本研究显示p63蛋白在DLBCL中表达阳性率为44.4%，而在RHL呈阴性表达，提示p63高表达与DLBCL的发生发展有关。由于本研究所用的p63抗体能对所有p63蛋白异构体起反应，所以在DLBCL进展中究竟以哪一类异构体发挥作用，尚待进一步研究。

Bcl-2是一种重要的抗凋亡基因，在正常B细胞发育和分化中起重要作用。Bcl-2蛋白高表达与淋巴瘤发病、化疗或放疗抵抗等有关[18]。国内杨海燕等[19]研究结果显示Bcl-2蛋白在non-GCB型DLBCL中的表达率高于GCB型，且与DLBCL不良预后有关。而魏华萍等[20]研究发现Bcl-2蛋白与整体DLBCL预后无关，但在60岁以上DLBCL患者中具有明确的预后价值，与预后不良显著相关。本研究数据显示Bcl-2蛋白在DLBCL中表达阳性率为82.2%，虽然与前项研究报道相近，但在GCB型与non-GCB型间表达无显著差异，且与年龄等临床病理参数无明显相关性。

新近研究发现Hippo-Yes相关蛋白信号通路与p63或Bcl-2之间可能存在交互作用。Saladi等[21]实验显示ACTL6A/p63复合物能够活化Yes相关蛋白、促进头颈部鳞癌的发生，ACTL6A和Yes相关蛋白高表达与患者预后不良有关。Wen等[22]研究显示敲除Yes相关蛋白可促进人牙周膜干细胞的凋亡，从而抑制其增殖，并证实此调控过程是通过Hippo-Yes相关蛋白信号通路与Erk和Bcl-2 信号通路之间交互作用而实现的。本研究中，Yes相关蛋白、p63和Bcl-2在DLBCL均呈异常表达，但三者间无相关性，提示它们可能分别通过不同机制参与了DLBCL的发生发展。

综上所述，本研究表明Yes相关蛋白、p63和Bcl-2蛋白在DLBCL中存在异常表达，与DLBCL的发生发展密切相关，但三者无明显相关性。Yes相关蛋白在DLBCL中低表达的具体分子机制尚需要进一步研究。