川芎嗪注射液对缺氧状态下视网膜血管内皮细胞增殖作用的影响

吴沂旎，吴宁玲，庄曾渊，郝进

近年来研究认为[1]，由于各种原因引起的缺血性眼底病变，与视网膜血管内皮细胞 （retina vascular endothelial cell,RVEC）受损及继发出现的血管活性因子失衡有关，保护RVEC免受损伤是防治这类疾病的新途径。川芎嗪具有活血化瘀、扩张血管、改善微循环、抗血小板聚集等作用，已被广泛应用于青光眼[2]、缺血性视神经病变[3]、视网膜静脉阻塞、糖尿病视网膜病变[4]等眼病，但因为关于川芎嗪对RVEC作用的研究甚少，有关该药对RVEC的保护作用尚不明确。本文以缺氧状态下培养的牛视网膜血管内皮细胞为对象，观察了不同浓度川芎嗪对其生长、增殖的影响，现报告如下。

1　材料与方法

1.1　药物与试剂

DMEM培养基（美国 Gibco），牛源内皮细胞生长因子（购于中日友好医院细胞实验室），胎牛血清（美国 Gibco），磷酸川芎嗪注射液（规格：50mg，瑞阳制药有限公司），谷氨酰胺、双抗、肝素、MTT（四甲基偶氮唑盐），牛视网膜血管内皮原代细胞（购于北京中日友好医院细胞库）。ELX808酶标仪 （美国Bio-Tek公司产品）；倒置显微镜 （日本Olympus公司）

1.2　实验方法

1.2.1细胞培养：将购买的牛视网膜血管内皮细胞(RVECs)原代细胞进行复苏，取出内皮细胞冻存管迅速置于38℃水浴锅中，使其快速融化，将细胞悬浊液移入离心管中，离心后并加入DMEM完全培养液[含 200 g/L FBS、100 mg/L内皮细胞生长添加剂（endothelial cell growth supplement,ECGS）、100mg/L肝素以及1 g/L双抗]，并移入铺满明胶的75 ml培养瓶。置于5%CO2，37℃的培养箱中。第2天待细胞贴壁后换液。细胞生长旺盛，4～5 d可传代1次，取第7～8代的细胞用于实验。

1.2.2实验分组：实验分为3组。A.正常细胞对照组：用不含血清、生长因子的DMEM常规培养基培养。B.缺氧模型组：正常细胞对照组+终浓度1000 μmol/ml CoCl2。C.缺氧+不同浓度川芎嗪组：缺氧模型组+不同浓度的川芎嗪 （0.002、0.02、0.2、2 μg/ml，分别记作川芎嗪 1、2、3、4组）。

1.2.3川芎嗪对RVEC增殖影响的测定：制备第7代牛视网膜血管内皮细胞悬浊液，调节其密度为1×105个/ml，种于 96 孔培养板上，每孔种植 200 μl细胞悬液，在培养箱中培养24 h。细胞贴壁后，将细胞分成6组，每组5个平行孔，每孔200 μl培养液，培养24 h。实验结束前4 h向每孔加入20 μl MTT，实验结束后，小心弃去培养孔内的培养基，每孔加入二甲亚砜150 μl，在摇床上震荡10 min混匀，待蓝色结晶完全溶解后，用自动酶标仪（波长492 nm）测定各孔光密度[D(492 nm)]值。该值可间接反映活细胞数量，用以检测细胞活性。另设各组细胞培养48 h后观察，方法同上。实验重复5次。以正常细胞对照组的细胞增殖率为100%，其他各组的细胞增殖率=[该组 D(492 nm)值/正常细胞对照组 D(492 nm)值]×100%。

1.2.4统计学处理

2　结果

2.1　细胞形态的变化

倒置相差显微镜观察，正常细胞传代4 h开始贴壁生长，融合成片，有的呈放射状排列，活细胞透亮，呈梭形、多角形或椭圆形，相互之间连接紧密（图1A）。在缺氧环境下，细胞数目明显减少，细胞间隙增大，可见部分凋亡细胞（图1B）。川芎嗪注射液作用24 h、48 h后的细胞培养液由橙红色变成砖红色，细胞形态有些变为短梭形，凋亡细胞数目明显减少，细胞数量增多，成片融合，细胞紧密排列，呈典型的铺路卵石样结构（图1C、1D）。

2.2　川芎嗪对细胞生长的影响

图1　倒置相差显微镜观察各组牛视网膜血管内皮细胞生长情况。1A.正常细胞传代4 h开始贴壁生长，有的呈放射状排列，活细胞透亮，呈梭形，相互之间连接紧密；1B.在缺氧环境下，细胞数目明显减少，细胞间隙增大，可见部分凋亡细胞；1C.川芎嗪注射液作用24 h后细胞形态有些变为短梭形，凋亡细胞数目明显减少，细胞数量增多，细胞紧密排列；1D.（48h 川芎嗪 0.2μg/ml）基本同 1C。

缺氧模型及药物组各时间点的光密度值均较正常细胞对照组低（P＜0.01），加入 0.002 μg/ml川芎嗪后未见明显变化，与缺氧模型组接近（P＞0.05）；当浓度增加至0.02、0.2 μg/ml时，细胞的光密度值开始明显增加，高于缺氧模型组（P＜0.01），以川芎嗪0.2 μg/ml组的数值最高，但仍低于正常细胞对照组（P＜0.05）；浓度增加至 2 μg/ml时，其光密度值下降，推测该浓度可能出现了药物毒性作用而抑制细胞增长。各组不同时间点的平均光密度及细胞增值率见表1。

表1　MTT法测定川芎嗪注射液对缺氧状态下RVEC增殖的影响（¯±s，n=6）

表1　MTT法测定川芎嗪注射液对缺氧状态下RVEC增殖的影响（¯±s，n=6）

注：*LSD 方法两两比较，与正常细胞对照组比较，24h：P（缺氧组）=0.000；P（0.002 组）=0.000；P（0.02组）=0.000；P（0.2组）=0.003；P（2 组）=0.000；48h*P（缺氧组）=0.000；P（0.002 组）=0.000；P（0.02 组）=0.000；P（0.2 组）=0.043；P（2 组）=0.000。#LSD 方法两两比较，与缺氧模型组比较，24h：P（0.002组）=0.105；P（0.02组）=0.000；P（0.2组）=0.000；P（2 组）=0.153；48h：P（0.002 组）=0.082；P（0.02 组）=0.000；P（0.2组）=0.000；P（2组）=0.296。 MTT：四甲基偶氮唑盐;RVEC：视网膜血管内皮细胞

组别　D(492 nm)培养24 h　培养48 h正常细胞对照组缺氧模型组川芎嗪 1 组（0.002μg/ml）川芎嗪 2 组（0.02μg/ml）川芎嗪 3 组（0.20μg/ml）川芎嗪 4 组（2.00μg/ml）0.426±0.114 0.256±0.011*0.282±0.109*#0.364±0.015*#0.410±0.010*#0.264±0.011*#F值P值0.460±0.021 0.274±0.005*0.290±0.007*#0.376±0.008*#0.428±0.019*#0.288±0.019*#142.3 0.000 205.9 0.000

3　讨论

视网膜血管内皮细胞受损是引起因各种缺血性眼底病变病理性变化的始动因素。血管内皮细胞构成了血管的光滑内衬，便于血液流动，并具备复杂的酶系统，能合成与分泌多种生物活性物质，这些血管活血物质当中，最为经典的是一氧化氮（nitric oxide,NO）及内皮素-1（endothelin-1,ET-1）。NO 和 ET-1 的变化是反映血管内皮细胞损伤最确切、最直接的标志[5]。生理情况下ET-1具有强烈收缩血管作用，可导致血流缓慢，促使血栓形成，而NO具有抑制血管内皮素分泌，扩张血管及调节平滑肌细胞增殖的作用，并能抑制血小板凝集、黏附及抑制白细胞黏附。NO和ET-1协调平衡，维持着血管外周阻力和局部血管的舒缩状态，调节着视网膜的血液循环。缺氧是许多血管疾病中常见的病理现象，可在多个方面造成血管内皮细胞的损伤[6]，导致NO释放减少和ET-1增加，血管舒缩功能失调、血小板凝聚，加速血栓形成，促使眼底病变进展。因此，寻找有效保护视网膜血管内皮细胞（RVEC）的药物对于防治缺血性眼底病变具有重要意义。

川芎嗪又名四甲基吡嗪，是中药川芎的提取物，具有抑制环核苷酸磷酸二脂酶的活性，可提高血小板中环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）含量，降低血小板表面活性，从而抑制血小板聚集，防止血栓形成，并有轻度的溶解作用[7]。已有研究报道川芎嗪能保护在缺氧环境下受损的人脐静脉内皮细胞，调节其分泌功能和血管舒缩功能，致ET水平明显下降，NO水平明显上升[8]，并能使血浆中氧自由基引起脂质过氧化反应的代谢产物MDA下降，使氧自由基清除剂SOD的活性升高。另有研究表明川芎嗪对视网膜缺血再灌注损伤具有保护作用，可减少缺血后视网膜细胞的凋亡[9]，清除氧自由基，对抗视网膜缺血再灌注损伤所介导的氧化反应，以及有效稳定细胞膜、降低脂质过氧化产物[10]。而对于川芎嗪是否能促进缺氧状态下视网膜内皮细胞的增殖，国内外尚未见报道。

本实验中，我们采用MTT法检测缺氧状态下不同浓度川芎嗪对RVEC生长的影响，结果发现川芎嗪0.02、0.2 μg/ml组的光密度值较缺氧组明显升高，且后者的数值更高，提示在一定浓度范围内川芎嗪对缺氧状态下培养的RVEC具有促增殖作用，并存在一定的剂量-效应关系，这可能是其保护RVEC及RVEC功能的机制之一。当浓度升高至2 μg/ml时测量到的光密度值反而下降，推测可能在此浓度时出现药物的毒性作用，抑制细胞增长。

本研究结果显示，川芎嗪可抑制缺氧引起的RVEC活性降低，对细胞的增殖有一定的促进作用，推测该药能在一定程度上阻断内皮细胞受损导致的一系列病理变化，进而减轻眼部的病理改变，发挥对RVEC的保护作用。目前有关川芎嗪对眼科疾病作用机制的实验研究不多，对于该药在RVEC保护作用等方面的深入探索，不仅能为川芎嗪治疗视网膜静脉阻塞等缺血性眼底病变提供重要的药理学依据，也有助于其在眼科领域发挥更大的作用。