岩原鲤MSTN基因克隆及饥饿对MSTN表达的影响

刘恩秀，朱仙珍，李　云，吴荣华，英士娟，杨　帆，胡　鑫，郭　鹤

(1.西南大学动物科技学院，重庆三峡生态渔业产业技术研究院，重庆400715；2.淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆400715；3.水产科学重庆市市级重点实验室，重庆 400715)

肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)，又称生长分化因子8(growth differentiation factor 8，GDF-8)，属转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)超家族成员，是动物肌肉发育和生长过程中的负调控因子[1]。MSTN的N-端有一段由非亲水性氨基酸序列构成的信号肽；C-末端包含9个保守的半胱氨酸的活性区，靠分子间的二硫键形成二聚体发挥功能[2]；紧挨着C-末端的活性区有4个氨基酸组成的蛋白酶加工水解位点(RSRR)[3]。

1997年，McPherron等[4]在对小鼠的实验中发现该基因具有抑制肌肉发育的生物学特性。随后，并以小鼠保守的C-端cDNA为探针筛选不同物种的骨骼肌cDNA文库，克隆了大鼠、人、猪等的cDNA序列。在鱼类的研究中，斑马鱼(Daniorerio)[5]、鲤鱼(Cyprinuscarpio)[6]、罗非鱼(Oreochromismossambicus)[7]、斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[8]、刀鲚(Coilianasus)[9]、缩骨鲫(Carassiusauratussoguvar)[10]等的MSTN基因已经相继被克隆。研究表明哺乳动物的MSTN基因主要在骨骼肌中表达，而鱼类的MSTN基因除了在骨骼肌表达以外，还可在多个组织中表达。

岩原鲤(Procyprisrabaudi(Tchang))属鲤形目鲤科鲤亚科原鲤属[11]，主要分布于长江上游水系干、支流及金沙江中下游的江河中[12]，是长江上游珍稀特有经济鱼类。由于过度捕捞及生境变化，岩原鲤自然种群数量急剧减少，已被列为易危物种[13]。近期岩原鲤规模化人工繁养已经成功[14-15]，但是其生长较慢，养殖周期长，限制了其产业化推广。近年来对岩原鲤的研究主要有HSC70[16]、促性腺激素[17]等基因的克隆，尚未见对岩原鲤MSTN基因的克隆。本研究通过对岩原鲤MSTN基因克隆、组织表达及饥饿胁迫下岩原鲤MSTN基因表达变化研究，了解营养胁迫对其生长的调控机理，可为该鱼的营养与生长调控研究提供基础资料。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

岩原鲤购自重庆市万州水产研究所，每尾体重约100 g，将试验鱼活体运回实验室后先暂养2 d，然后选用健康活泼、体格健壮的进行试验。

Trizol试剂、M-MLV 第一链 cDNA 合成试剂盒、胶回收试剂盒、pMD18-T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞、T4 DNA Ligase、 Taq DNA 聚合酶、DNA maker均购自上海生物工程有限公司。

1.2　方法

1.2.1总RNA提取及MSTN基因克隆

采用Trizol法提取岩原鲤肌肉总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，核酸蛋白测定仪检测总RNA的浓度后，根据M-MLV 第一链 cDNA 合成试剂盒说明，反转录合成cDNA第一链。根据斑马鱼(Daniorerio)MSTN基因序列设计3对特异性引物MSTN- f1、MSTN- S1，MSTN- f2、MSTN- S2，MSTN- f3、MSTN- S3(表1)，以肌肉组织总RNA反转录获得的cDNA为模板，PCR扩增获得基因片段。胶回收纯化后，连接到 PMD18-T 载体，转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，菌液PCR扩增后送往华大基因测序。

1.2.2序列比对及进化树分析

获得基因序列后NCBI 在线BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)分析岩原鲤MSTN与其他同源蛋白的相似性。CLUSTALW(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)和 GeneDoc 软件进行氨基酸的多序列比对。运用DNAMAN软件对基因和蛋白质序列多重比对和同源性分析。用MEGA 4.0生物学软件，通过Neighbor-Joining算法，Bootstrap重复1 000次建立系统进化树。

1.2.3逆转录PCR(RT-PCR)分析

根据已克隆出的岩原鲤MSTN序列信息，以β-actin作为内参基因，引物为β-actin S和β-actin A(表1)，用MSTN 3’末端的基因特异引物对岩原鲤不同组织进行半定量RT-PCR分析。

1.2.4饥饿再投喂对岩原鲤MSTN的表达调控

将360尾试验岩原鲤随机分成两个组(试验组和对照组)，每组设置三个重复，组间初始体重差异不显著(P>0.05)。试验开始后，试验组饥饿处理15 d，之后恢复投喂9 d，对照组正常投喂。水温(25±2)℃， pH 6.5～6.8，DO 5.6～8.8 mg/L。分别在饥饿0、2、4、6、9、12、15 d，以及恢复投喂的3 d(18 d)、6 d(21 d)和9 d(24 d)早上投喂前取样。试验组、对照组的三个重复缸中随机各抽取3尾鱼，取其肌肉组织，提取RNA，半定量RT-PCR检测其不同时间段MSTN基因的表达含量。

表1　实验中所用引物Tab.1　Primers used in the experiment

2　结果与分析

2.1　岩原鲤MSTN基因cDNA序列分析

3条特异性扩增片段经测序后拼接，获得了岩原鲤MSTN基因1 547 bp的cDNA序列(GenBank登录号:GU553283)。BLAST检索同源序列显示，该序列与鱼类等脊椎动物MSTN cDNA有较高的同源性。该cDNA序列包括23 bp的5′非编码区序列(5′UTR)和396 bp的3′非编码区序列(3′UTR)。开放阅读框(ORF)为1 128 bp，编码的375个氨基酸残基构成前体蛋白，其分子质量预测值为42.1 kd，等电点pI为6.27。22个氨基酸残基构成信号肽，信号肽切割位点在Gly22和Asp23之间。前体蛋白序列中有一个蛋白酶水解位点RIRR，位于第263～266位氨基酸。蛋白酶水解位点之后的C端肽段区域为C端活性区，含有9个保守的Cys残基。试验所得岩原鲤的MSTN cDNA核苷酸序列及其推导的氨基酸序列见图1。

图1　岩原鲤MSTN的核苷酸序列及推测的氨基酸序Fig.1　Nucleotide sequence encoding the MSTN of P.rabaudi and the deduced amino acid sequence

氨基酸序列位于核苷酸序列下面。起始密码子、终止密码子加粗表示；信号肽用加下划线表示；酶切位点用方线表示；半胱氨酸残基用阴影表示

2.2　同源性及进化关系分析

由 NCBI 获得其他相关物种的MSTN基因序列。从表2中可以直观地看到，岩原鲤MSTN编码区氨基酸序列与鲤科鱼类的同源性最高，与鲤鱼同源性高达98.4%；与南亚野鲮同源性达98.1%；与稀有鮈鲫同源性达98.1%；与草鱼、斑马鱼、厚颌鲂的氨基酸序列同源性分别为97.3%、96.3%、97.9%。与其它鱼类的同源性都在80%左右，而与鸟类、哺乳类的同源性相对较低。运用DNAMAN软件对MSTN氨基酸序列进行多重比对，发现岩原鲤MSTN氨基酸序列与许多物种的MSTN氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化分析显示，岩原鲤与来自鲤科鱼类的鲤鱼、稀有鮈鲫、厚颌鲂、草鱼、斑马鱼、南亚野鲮的MSTN蛋白组成一个紧密的亚群，而与东方红鳍鲀、美洲鲈、石首鱼的MSTN蛋白亚群距离比较远(图2)。

表2　岩原鲤与其他物种MSTN核苷酸和氨基酸同源性比较Tab.2　Homology analysis of MSTN cDNA sequences and amino acid among P.rabaudi and other animals

图2　岩原鲤与其它物种MSTN的系统进化树Fig.2　Phylogenrtic tree based on MSTN deduced amino acids of P.rabaudi and other species

2.3　MSTN mRNA在不同组织中的表达分析

岩原鲤MSTN 的组织RT-PCR 检测结果表明(图3)，该基因在肌肉和脑组织中表达较高，在眼、肠、心、鳃、肾和头肾组织中有少量表达，而在肝胰脏、脾脏组织中未见表达。以β-肌动蛋白基因为对照，同时进行了不同组织的半定量RT-PCR 检测，在所检测的组织样品中均得到β-肌动蛋白基因的特异扩增带。

图3　岩原鲤不同组织MSTN mRNA的RT-PCR检测结果Fig.3　The RT-PCR results of MSTN mRNA in different tissues of P.rabaudi上图为岩原鲤MSTN ,下图为岩原鲤β-肌动蛋白

2.4　饥饿再投喂对岩原鲤肌肉组织MSTN表达含量的影响

半定量RT-PCR检测不同时间段MSTN表达含量，PCR产物电泳结果如图4。凝胶成相系统分析电泳结果，用SPSS软件处理试验数据，结果如图5所示，饥饿2 d、4 d后岩原鲤肌肉组织中MSTN基因表达含量差异不显著(P>0.05)；饥饿6 d、9 d、12 d时肌肉组织中MSTN基因表达含量与对照组相比差异极显著(P<0.01)，且MSTN基因表达含量逐渐增高；继续饥饿至15 d时，MSTN基因表达含量达到最高值；在饥饿15 d后对试验动物进行投饵，结果表明在投饵后3 d(即试验第18 d)肌肉组织中MSTN基因表达含量急剧下降，达到最低值；投饵后6 d、9 d(即试验第21 d、24 d)MSTN表达含量升至正常水平，与对照组差异不显著(P>0.05)。试验结果表明饥饿可导致肌肉组织中MSTN表达含量显著升高，重新投喂饵料后3 d内肌肉组织中MSTN基因表达含量急剧下降，3～6 d内MSTN基因表达含量逐渐恢复到正常水平。

图4　RT-PCR分析岩原鲤试验组(A)和对照组(B)肌肉组织中MSTN mRNA表达水平Fig.4　RT-PCR analysis of MSTN mRNA expression in muscle of test group(A)and control group(B)MSTN序列长度为601 bp，β-actin序列长度为397 bp

图5　饥饿对岩原鲤肌肉组织中MSTN表达含量影响Fig.5　Relative MSTN mRNA expression levels of P.rabaudi in muscle subjected to feed deprived(FD)0、2、4、6、9、12、15表示饥饿时间段，18、21、24 d表示在饥饿15 d后恢复投饵时间段，*表示差异显著，**表示差异极显著

3　讨论

研究表明，虽然鸟类、哺乳类与鱼类的亲缘关系相对较远，但MSTN基因的同源性较高，其相似度都在60%以上，尤其是在C-末端成熟的蛋白活性区域，具有更高保守性。氨基酸序列的变化，可能会导致蛋白质功能的变化，C-末端是生物活性区，尤其是其中的半胱氨酸，属于保守氨基酸，变异会导致功能的重大改变[18]。序列上的保守性特别是活性区域的保守性暗示着鱼类MSTN基因在功能上与哺乳类MSTN基因可能有某种程度的相似性，不同物种间的MSTN可能是由相同的祖先进化而来的[19]。

RT-PCR 结果表明，岩原鲤MSTN基因在肌肉和脑组织中表达较多，这与斑马鱼[20]、鲤鱼[6]、草鱼[21]、团头鲂[22]等的研究结果一致。而岩原鲤MSTN基因在眼、肠、心、鳃、肾和头肾等组织中有少量表达，在肝胰脏和脾脏中未见表达，这又与这些在分类地位上很相近的鱼有所区别[23]，表明MSTN基因表达的组织特异性较强。与哺乳动物相比，鱼类MSTN基因组织分布较广泛，研究表明哺乳动物MSTN基因主要在肌肉组织中表达[1]，而在其他组织中表达较少。

饥饿再投喂实验表明，岩原鲤肌肉组织中MSTN基因表达含量随着饥饿时间的延长而逐渐增高，恢复投喂后MSTN基因表达含量急剧下降，6 d后恢复至正常水平。这与Terova等[24]对鲈鱼和韩明星等[25]对大黄鱼的研究一致。Li等[26]对岩原鲤饥饿再投喂实验表明随着饥饿时间的延长，岩原鲤肌肉组织中蛋白质含量、RNA/DNA比率逐渐降低，恢复投喂后表现出不同程度的补偿性增长。肌肉是鱼体最大的组织，也是蛋白质合成的主要组织，MSTN是肌肉生长的上游调控因子，饥饿胁迫下，鱼体缺乏外源食物供能，岩原鲤通过转录水平调节MSTN基因的表达，激活其信号通路，从而上调肌肉组织中MSTN的表达量来抑制肌肉细胞的生长、发育和分化，尽量减少用于肌肉细胞蛋白质合成的能量消耗，使鱼体的储能用于维持基本的生命活动。

综上，本研究克隆了岩原鲤肌肉生长调节基因MSTN的cDNA序列，其主要表达在肌肉和脑组织，饥饿显著上调肌肉组织MSTN的转录水平，恢复投喂显著下调其转录水平，表明MSTN的表达对营养摄入非常敏感，提示其可能是能量摄入与生长调控的主要调节分子，这些结果可为岩原鲤的营养及生长调控研究提供基础数据。