广西北海蔗区甘蔗白条病发生情况调查

韦金菊 魏春燕 宋修鹏 覃振强 谭宏伟 张荣华 庞天 王伦旺 刘璐 李杨瑞

摘要：【目的】对广西北海蔗区疑似发生甘蔗白条病的样本进行PCR检测鉴定，明确甘蔗白条病在广西北海的发生情况，为甘蔗白条病的防控提供科学依据。【方法】2016年11月，在广西北海合浦县、银海区和铁山港区采集疑似甘蔗白条病样本372份，涉及19个甘蔗品种/系，采用甘蔗白条病病原白条黄单胞菌[Xanthomonas albilineans（Ashby）Dowson]特异引物XAF1和XAR1对采集样本的DNA进行PCR检测。对部分有阳性条带的PCR产物进行切胶回收，并送样测序，然后在NCBI上进行BLAST比对分析。【结果】所采集的372份样本中，有78份样本扩增出目的条带，阳性检出率为20.97%；19个甘蔗品种中，有13个品种检测出阳性条带，检出率为68.42%，其中白叶病检出率较高的是柳城07-95、桂糖46号、桂糖42号和柳城07-536，检出率分别为75.00%、68.75%、48.15%和33.33%。部分阳性条带经克隆后测序，在NCBI上进行BLAST比对分析，发现其与广西白条病分离物KY315212.1的同源性为99%，表明它们均属于甘蔗白条病基因片段序列。【结论】甘蔗白条病已在广西北海蔗区发生危害，今后需加强检疫工作，防止从疫区调运感病蔗种，以控制病害进一步扩散蔓延。

关键词： 甘蔗白条病；调查；PCR检测；广西北海

中图分类号： S412 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）02-0264-07

Abstract：【Objective】Sugarcane with suspected leaf scald disease in Beihai sugarcane fields in Guangxi were identified by PCR test to determine whether the disease occurs in Beihai， Guangxi， and to provide scientific basis for the control of sugarcane leaf scald. 【Method】In November， 2016， 372 sugarcane samples with suspected leaf scald disease in Hepu County， Yinhai District and Tieshangang District of Beihai， Guangxi were collected， which belonged to 19 varie-ties/lines. PCR test was conducted on DNA of the samples collected using specific primers XAF1 and XAR1 of Xanthomonas albilineans（Ashby） Dowson（pathogeny of sugarcane leaf scald）. PCR products with positive bands were reco-vered and sequenced， than BLAST comparison of the results were conducted in NCBI. 【Result】In the 372 samples， there were 78 samples amplified target bands with positive detection rate being 20.97%. Out of 19 sugarcane varieties， 13 ones had target band with positive detection rate being 68.42%. The sugarcane varieties with high positive detection rate of sugar-cane leaf scaldwere Liucheng 07-95（75.00%），Guitang 46（68.75%），Guitang 42（48.15%）， Liucheng 07-536（33.33%）. Partial positive bands were cloned and sequenced， then BLAST comparison of their sequences were conducted in NCBI. The results showed that they had 99% homology with the Guangxi leaf scald disease isolate KY315212.1， which confirmed that they belonged to leaf scald disease gene fragment sequences. 【Conclusion】Sugarcane leaf scald disease occurs in Beihai， Guangxi. Therefore， quarantine must be strengthened and diseased sugarcane cannot be transported from infected area to prevent the further spread of the disease.

Key words： sugarcane leaf scald； investigation； PCR test； Beihai， Guangxi

0 引言

【研究意义】甘蔗白条病（Sugarcane leaf scald）又名甘蔗叶灼病，是一种细菌性维管束病害，由白条黄单胞菌[Xanthomonas albilineans（Ashby） Dowson]引起（Rott and Davis， 2000）。该菌菌落在蔗糖和蛋白胨培养基上为黄色和淡黄色，革兰氏染色反应阴性，极生单根鞭毛。病害可通过种苗、砍蔗工具等传播蔓延（Birch， 2001），美国、柬埔寨、越南和墨西哥等60多个国家和地区已有甘蔗白条病发生的报道（Davis et al.，1994； Hoy and Grisham，1994； Rott et al.， 1994； Pan et al.，1997）。甘蔗白条病分急性型和慢性型两种，慢性型主要为害甘蔗叶片，叶片上产生白色至乳黄色长条纹，后期病叶从叶尖至叶缘逐渐干枯至全叶枯萎，似被沸水烫过，叶灼病由此得名；病株节间变短，叶形短直，易长出白条纹的侧芽和分蘖。急性型症状主要表现为整株甘蔗凋萎而死，通常一丛甘蔗中有1～2条患病而其他蔗株表现正常。甘蔗白条病常在耐病品种中潜伏而不表现症状，或症状表现不明显，当品种更换为不耐病品种时，该病可能会突然形成流行性病害，对甘蔗产量和糖分产生严重影响（Hoy and Grisham，1994）。因此，必须重视和加强对该病害的检疫及预防工作，确保广西甘蔗食糖安全和糖业的可持续发展。【前人研究进展】国内外对甘蔗白条病的研究主要集中在病害检测、发病机理及病原毒素研究方面。已有研究表明，白条黄单胞毒素和细胞壁降解酶（CWDEs）均有可能是甘蔗白条病的致病因子（Roper et al.， 2007； Chatterjee et al.，2008； Perez-Donoso et al.，2010； Rott et al.，2011）。甘蔗白条病黄单胞菌的高致病性菌株GPEPC73已获得基因组全序列，大小约3.8 M，比其他黄单胞菌菌株的基因组（约5.0 M）小（Pieretti et al.，2012）。目前国内对甘蔗白条病的研究较少，主要集中在病原检疫检测（李文凤等，2016）及病害调查方面。在广东（黄鸿能，1993）、海南（熊国如等，2010）和福建（李瑞美，2016）等蔗区均曾报道发生甘蔗白条病。2016年，李文凤等（2017）在广西发现甘蔗白条病，并利用白条黄单胞菌特异引物XAF和XAR对样品DNA进行PCR扩增，获得大小约600 bp的特异片断，经对部分特异片段回收测序，BLAST检索结果表明所得片段序列与GenBank中登录的白条黄单胞菌raxB1基因的核苷酸序列同源性为100%。【本研究切入点】甘蔗白条病是检疫性病害，极易随种苗传播，对甘蔗产业发展具有潜在威胁。目前该病的防治措施主要是加强检疫，控制病害大面积传播和暴发。2015～2016年广西北海蔗区陆续发现疑似甘蔗白条病症状的病株，本研究团队立即进行大田采样检测，鉴定疑似甘蔗白条病的病株，调查发生情况和发病品种。【拟解决的关键问题】采用甘蔗白條病病原白条黄单胞菌特异引物XAF1和XAR1对广西北海蔗区发生的疑似甘蔗白条病样本的DNA进行PCR检测，明确甘蔗白条病在北海的发生情况，为甘蔗白条病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 样品采集 2016年11月，在广西北海合浦县、银海区和铁山港区采集疑似甘蔗白条病样本（图1），按五点取样法取样，每点取3个甘蔗样本，共采集样本372份，涉及19个甘蔗品种/系（表1）。样本用封口袋封口，写好标签，带回实验室。

1. 1. 2 主要试剂和仪器设备 2×Taq PCR Master Mix购自生工生物工程（上海）股份有限公司； Wolact? Plant Genomic DNA Purification Kit植物基因组DNA提取试剂盒购自凯联生物技术有限公司； 阳性对照DNA由云南省农业科学院甘蔗研究所提供，空白对照为灭菌双蒸水；PCR仪为德国Biomentra公司产品；Bio-Rad凝胶成像系统为美国伯乐公司产品。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 蔗茎DNA提取 取蔗茎组织（定量），用液氮研磨至白色粉末状，按照Wolact公司生产的植物DNA提取试剂盒说明提取蔗茎DNA，并溶于100 μL 1×TE缓冲液中，置于-20 ℃保存。

1. 2. 2 引物设计 引物序列采用文献（Wang et al.， 1999）报道的甘蔗白条病病菌[X. albilineans （Ashby） Dowson]基因保守序列设计特异引物，XAF1：5'-CCTGGTGATGACGCTGGGTT-3'；XAR1：5'-CGATCAGCGATGCACGCAGT-3'，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，预期产物大小为600 bp。

1. 2. 3 PCR检测 PCR检测参考李文凤等（2016）的方法并有所改进。PCR反应体系（20.0 μL）：DNA 模板3.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 8.0 μL，上、下游引物各 0.2 μL（20 μg/μL），ddH2O 8.6 μL。 扩增程序：95 ℃预变性 5 min；94 ℃ 45 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，进行10个循环；94 ℃ 45 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，进行10个循环；94 ℃ 45 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，进行10个循环； 72 ℃延伸10 min。每个样品进行3次重复扩增检测。

1. 2. 4 电泳检测 取8.0 μL扩增产物，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，在Image Maker VDS成像仪照像，根据PCR有无特异扩增条带，有特异条带的经凝胶回收试剂盒回收纯化后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。所得序列在NCBI中进行BLAST比对分析。

2 结果与分析

2. 1 PCR检测结果

对采集到的372个甘蔗样本进行PCR检测，经凝胶成像系统观察，扩增出特异条带的为阳性，说明所采集的样品中存在甘蔗白条病病原。健康蔗株、阴性对照和双蒸水空白对照未能扩增出目的条带。部分样品的PCR电泳结果见图2。

2. 2 疑似白条病PCR扩增产物测序结果及序列分析

从检测结果为阳性的样本中随机选取部分PCR产物回收后进行连接、转化，挑取阳性克隆进行测序，目的片段大小均为600 bp，经BLAST比对分析，发现其与白条黄单胞菌（X. albilineans）序列广西分离物KY315212.1有99%的同源性（图3），因而确定为是白条黄单胞菌引起的甘蔗白条病。

2. 3 广西北海甘蔗白条病发生情况调查结果

分别提取样本DNA进行PCR检测，结果（表2）显示，19个甘蔗品种中有13个品种检测出阳性条带，阳性检出率为68.42%；372份样本中有78份樣本检测出阳性条带，样本白条病检出率为20.97%。阳性检出率较高的是柳城07-95、桂糖46号、桂糖42号和柳城07-536，检出率分别高达75.00%、68.75%、48.15%和33.33%；其次是桂糖10-2003、云蔗06-407、粤糖00-236、桂糖07-108、台糖98-0432 、桂糖49号、柳城05-136、桂糖08-1180和新台糖22号，阳性检出率为6.67%～20.00%；桂糖43号、桂糖44号、粤糖93-159、福农09-4095、福农39号和台引CE02-67等6个甘蔗品种的阳性检出率均为0；桂糖46号以组培苗繁殖的宿根一年甘蔗所采集的样本阳性检出率为0。

2. 4 广西北海不同区域甘蔗白条病发生情况

对所采集的372份样本按行政区铁山港区、银海区和合浦县进行分析，结果（表3）显示，北海市合浦县的甘蔗白条病检出率最高，达33.33%，其次为银海区（18.89%），铁山港区甘蔗白条病检出率为0。

3 讨论

据报道，甘蔗白条病在美国佛罗里达州、瓜德罗普岛和毛里求斯等地暴发危害是感病品种大面积种植的结果（Davis et al.， 1997），对甘蔗产量和糖分造成严重影响（Hoy and Grisham，1994），说明感病品种是该病发生严重危害的重要因素。在我国台湾，经鉴定对甘蔗白条病具有抗性的品种有NCO310、F156、F160和F173，较抗病的品种有Q42、Q50、Q98、Q813、POJ36、POJ2725、CP807、CP29-116、Co290、Co301、Co331和B4908（黄应昆和李文凤，2002）。通过转基因方法导入白条病解毒基因（albD）可减轻其危害症状，但未得到完全抗该病的品种（仓晓燕等，2017）。与此同时，甘蔗白条病潜伏侵染特性使无症带菌种蔗成为病害远距离传播的主要途径（王中康等，1998）。甘蔗白条病携带病菌具有隐藏性，肉眼难以区分正常植株与感病植株，因而尚未得到重视和采取任何防控措施，为该病害远距离传播蔓延带来了便利。甘蔗白条病在适宜环境下易呈突发性、毁灭性暴发危害，导致生产上防控处于措手不及的被动局面。因此，加强甘蔗白条病的症状、致病病原、侵染途径、病原检测（王中康等，1998；仓晓燕等，2017）和品种抗性分析与评价显得尤为重要。

甘蔗白条病在我国属于检疫性病害，曾在福建、江西和广东等地报道发生（全国甘蔗重要病害研究协作组，1991； 黄鸿能，1993），甘蔗白条病的诊断主要采用PCR检测（王中康等，1998；李文凤等，2017），甘蔗白条病发生的轻重与蔗田地势、土壤、栽培管理及品种等因素有关，蔗地低湿易积水诱发此病，大面积种植感病品种是该病发生流行的主要条件（仓晓燕等，2017）。本研究结果表明，广西北海甘蔗上发生的病害为甘蔗白条病，病原是甘蔗白色黄单胞菌[X. albilineans（Ashby） Dowson]，与李文凤等（2017）在广西北海、来宾和百色3个蔗区的检测结果一致。本次广西北海蔗区甘蔗白条病大面积、多品种发生，与种植易感品种和利于该病发生的气候条件相关。在以往的调查中，甘蔗白条病也有零星发生，但均未引起重视。在广西北海蔗区所调查的19个甘蔗品种中有13个品种检测出甘蔗白条病菌，其中在柳城07-95、桂糖46号、桂糖42号和柳城07-536的检出率较高，以银海区和合浦县蔗区较严重，表明甘蔗白条病病原菌在上述蔗区普遍存在。

控制甘蔗白条病的发生危害应选种不带该原病菌的蔗种。种植抗病品种是防治甘蔗白条病病害的最有效措施（仓晓燕等，2017）。在甘蔗品种调运扩繁过程中，需加强检验检疫，杜绝从甘蔗白条病疫区调运蔗种和留种，防止该病的大面积发生和传播（李文凤等，2009； 仓晓燕等，2017）；通过选用抗病品种、种苗温水处理、建立无病苗圃等生产无病种苗；对病区加强栽培管理，及时拔除烧毁病株、合理排灌、防止干旱（仓晓燕等，2017）等均可有效减轻病害的发生程度。

本研究对甘蔗白条病病原序列进行了比对，下一步将开展该病病原致病机理等研究，以便采取针对性抗病策略，保障广西甘蔗产业的可持续健康发展。

4 结论

对372份甘蔗样本的PCR检测结果表明，广西北海发生的甘蔗病害为甘蔗白条病，该病在桂糖46号等13个甘蔗品种上有发生，其中发生较严重的是柳城07-95、桂糖46号、桂糖42号和柳城07-536，以北海市合浦县蔗区发病最严重。今后需加强检疫工作，防止从疫区调运感病蔗种，以控制病害进一步扩散蔓延。

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（責任编辑 麻小燕）