一株色季拉山长鞭红景天根际溶磷菌的分离、鉴定及其低温适应性分析

陈甲瑞 巩文峰 邢瑜琪 卓玛曲措 岳海梅

摘要：【目的】從西藏色季拉山长鞭红景天根际土壤中分离筛选出溶磷菌株，为高寒植物根际促生菌的开发利用和丰富溶磷菌种质资源提供理论基础和科学依据。【方法】以长鞭红景天为研究物种，采用溶磷圈法从其根际土壤中分离溶磷菌，以钼锑抗比色法测定溶磷量进行复筛；筛选出溶磷效果最好的菌株，测定其产吲哚乙酸（IAA）、固氮促生特性，结合形态、生理生化特性和16S rRNA序列分析进行分类鉴定。以芽孢杆菌为对照，将芽孢杆菌和分离获得的溶磷菌株分别在4、10、15、20和30 ℃下培养7 d，研究其低温适应性。【结果】从长鞭红景天根际土壤中筛选出21株具有溶磷作用的菌株，其中PSB19菌株在PKO无机磷培养基上的溶磷圈直径/菌落直径（D/d）最高，液体溶磷量达392.15 μg/mL，具有产IAA和固氮特性，其在4和10 ℃的低温条件下生长良好。通过形态、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，将PSB19菌株归类于粘着箭菌（Ensifer adhaerens）。【结论】PSB19菌株有较好的溶磷、产IAA和固氮特性及低温适应性，具有作为生物菌肥在农业生产及植被恢复等方面应用的潜力。

关键词： 长鞭红景天；溶磷菌；筛选；鉴定；低温适应性

中图分类号： S154.381 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）02-0280-07

Abstract：【Objective】The strains with sound phosphate solubilizing capacity were isolated from rhizosphere soil of Rhodiola fastigiata in Sehgyla Mountains in Tibet， and their taxonomic status， growth promoting effects and low temperature adaptation were introduced to provide theoretical basis and reference for developing growth promotion rhizobacteria of psychrophytes and enriching phosphate solubilizing strain resources. 【Method】R. fastigiata was research species. Phosphate solubilizing ring method was applied to isolate phosphate solubilizing bacteria， and the method of Mo-Sb colorimetry was applied to measure phosphorus solubilizing capacity. The strains with the optimum phosphorus solubilizing capacity were selected， and their abilities of indoleacetic acid（IAA） production， nitrogen fixation and growth promotion were evaluated. These strains were graded based on morphology， physiological-biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence. Bacillus subtilis was used as control. B. subtilis and the strains isolated were cultured at 4， 10， 15， 20 and 30 ℃ for 7 d to study their low temperature adaptability. 【Result】From the rhizosphere soil of Rhodiola fastigiata， 21 bacterial strains with inorganic phosphate solubilizing capacity were selected. Phosphate solubilizing diameter/colony diameter（D/d） value of PSB19 was the highest in PKO liquid culture medium， and soluble phosphorus content reached 392.15 mg/L. PSB19 had ability of IAA secretion， nitrogen fixation， and grew well under low temperature（4 and 10 ℃）. Through morphology， physiology and biochemistry identification and 16S rDNA sequence analysis， strain PSB19 was classified as Ensifer adhaerens. 【Conclusion】Strain PSB19 has sound phosphate solubilizing capacity， IAA production， nitrogen fixation and low temperature adaptation. Therefore， it might act as a biological bacterial fertilizer for the application in agricultural production and revegetation.

Key words： Rhodiola fastigiata； phosphate solubilizing bacteria； selection； identification； low temperature adaptation

0 引言

【研究意义】土壤中有95%～99%的磷以难溶的金属螯合物形式存在，无法被植物根系吸收而影响植物的生长发育（Ramkumar and Kannapiran， 2011）。磷是植物生长发育所需的主要元素之一，在植物的光合作用、呼吸作用、能量运输、信号转导、大分子生物合成及豆科植物固氮等代谢过程中发挥着重要作用（Kouas et al.，2005；Khan et al.， 2010）。在农业生产中，农民通过增施可溶性磷肥来提高作物产量，但大部分的磷会与土壤中的Ca2+、Fe3+和Al3+等金属离子络合形成不溶性磷酸盐，从而降低了磷肥的有效性（史吉平等，1998；夏文建等，2017）。此外，长期施用化肥不仅导致土壤肥力丧失，土壤板结，土壤微生物多样性降低，还会造成生态环境污染（郑世仲等，2009）。尤其在西藏地区，大部分耕地处在高海拔、高寒环境，其土壤肥力较差，土壤中的磷素主要以铁磷、铝磷和钙磷等难溶态形式存在，很难被植物直接吸收（裴海，2002）。根际促生菌（PGPR）通过固氮、溶磷、代谢产生植物激素等直接或间接促进植物的营养元素循环，提高植物抗旱、抗寒及抵抗重金属污染的能力（Parray et al.，2016），其中，溶磷菌能提高土壤磷素有效性，减少磷肥使用量（Adesemoye et al.，2009；宋小敏等，2016；林英等，2017），因此，筛选出适应西藏高海拔、高寒的溶磷根际促生菌具有重要的生产意义。【前人研究进展】已有研究发现植物的根际存在多种溶磷菌。王舒等（2015）从红壤丘陵区油茶根际土壤中分离获得5株解磷能力较强的解无机磷细菌，采用形态特征、生理生化、Biolog系统和16S rDNA序列分析鉴定，确定WB38为耳假单胞菌（Pseudomonas auricularis），WB39（WB75）为杓兰果胶杆菌（Pectobacterium cypripedii），WB53（WB68）为路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii）；舒健虹等（2017）从扁穗雀麦根际分离得到多株菌株，不仅具有较高的溶磷活性，还对扁穗雀麦具有较好的促生作用；伍善东等（2017）从油菜地土壤中分离到4株对卵磷脂有不同降解能力的细菌，结合解有机磷细菌的菌落形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果，初步确定菌株JYP-1和JYP-4为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），JYP-2和JYP-3为桥石短芽孢杆菌（Brevibacillus choshinensis）；武志海等（2017）利用溶磷圈法从水稻根际土壤中分离获得2株对水稻具有明显促生作用的菌株，分别属于肠杆菌（Enterobacter sp.）和沙雷氏菌（Serratia sp.）。具有溶磷作用的菌株还有青霉属（Aspergillus）（王莉晶等，2009）、曲霉属（Penicillium）（龚明波等，2010）等，共生固氮菌也显示出溶磷活性（Zaidi et al.， 2009）；部分溶磷菌还能有效抑制作物病原菌，增强作物抗病力（Wani et al.， 2007；伍善东等， 2017）。在西藏地区，刘芳等（2010）筛选出具有耐低温和拮抗作用的细胞短杆状LSSC3，其对拟南芥有较好的促生作用，说明在西藏特殊地理气候条件下存在特殊的微生物资源。【本研究切入点】从国内外关于根际促生菌的文献报道中可看出，在特定环境条件下根际促生菌具有其特有性和多样性。目前，针对西藏这一特殊的地理单元，关于土壤根际促生菌中溶磷菌筛选的研究报道较少。【拟解决的关键问题】以生长在高海拔、高寒、低气压、高辐射、昼夜温差大的西藏色季拉山植物长鞭红景天为研究物种，对其根际土壤中的根际溶磷菌进行分离和筛选，并对筛选获得的高效溶磷菌株进行形态、生理生化、16S rDNA鉴定和低温适应性试验，以期为高寒植物根际促生菌的开发利用和丰富溶磷菌菌种资源提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试土样 从地处藏东南的色季拉山海拔超过4600 m的山顶挖取带完整根系的长鞭红景天（Rhodiola fastigiata；在色季拉山瘠薄的土壤条件下生长旺盛，是西藏主要的药用经济植物）植株根际土壤，用无菌袋装好密封带回实验室，置于4 ℃冰箱保存。

1. 1. 2 培养基 无机磷（PKO）固体培养基、LB培养基、NA培养基（李振高等，2008）及阿须贝无氮培养基（于文清等，2014）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 溶磷菌的初筛与纯化 采用稀释分离法分离溶磷菌。依次吸取稀释10-3、10-4、10 -5和10-6的土壤悬液各100.0 μL，分别涂布在PKO培养基上，28 ℃恒温倒置培养。培养9 d后，挑选菌落周围产生溶磷圈的菌落到NA培養基上进行分离纯化。出现单菌落后，NA培养基斜面培养24 h，然后置于4 ℃冰箱保存备用（杨慧等，2008）。

1. 2. 2 溶磷菌促生特性测定

1. 2. 2. 1 定性测定 将保存的初筛溶磷菌株进行活化，28 ℃培养24 h后点接于PKO培养基上，每菌重复3皿，28 ℃倒置培养9 d 后取出，测定溶磷圈直径（D）和菌落直径（d），计算D/d，根据D/d确定各初筛溶磷菌株的溶磷能力（吴翔等，2014）。

1. 2. 2. 2 定量测定 采用钼锑抗比色法（康慧颖等，2015），测定700 nm下的吸光值，绘制磷溶液标准曲线，计算溶磷量（?g/mL），从而进一步判断其溶磷能力。

1. 2. 2. 3 产吲哚乙酸（IAA）定性测定 选取D/d和溶磷量最高的菌株，采用Salkowski比色法测定其产IAA能力，参照李振东等（2010）的方法配制PC比色液和S2比色液。分别取溶磷菌培养液和空白对照50.0 ?L，分别加入50.0 ?L比色液， 置室温黑暗条件下静置30 min后观察其颜色变化，3个重复均变红色为阳性， 表示能分泌IAA， 颜色越深表示分泌数量越多；3个重复均不变色为阴性， 表示不分泌IAA。

1. 2. 2. 4 固氮特性 将溶磷菌连续转接5次到阿须贝无氮培养基上，均能正常生长的菌株视为具有固氮活性（代金霞等，2017）。

1. 2. 3 溶磷菌低温适生特性检测 将100.0 μL芽孢杆菌和溶磷菌菌液分别接种在盛有LB液体培养基的250 mL三角瓶中，以西藏微生物及植物病理重点实验室从林芝砂生槐根际土壤中分离获得的芽孢杆菌（该菌不能在低温下生长，数据未列出）为对照，分别在4、10、15、20和30 ℃下培养7 d，每24 h摇匀取培养液在530 nm下测吸光值（谢永丽等，2014；Meena et al.， 2015）。

1. 2. 4 溶磷菌鉴定及系统发育进化分析 溶磷菌的形态观察及生理生化测定方法参考《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）。

溶磷菌的16S rDNA PCR扩增及系统发育进化分析：细菌16S rDNA引物设计、PCR扩增参考马骢毓等（2017）的方法。PCR扩增体系50.0 μL：处理后的样品（70 ng/μL）模板2.0 μL；dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.5 μL；27F（20 μmol/L）1.5 μL；1492R（20 μmol/L）1.5 μL；10×Ex Taq Buffer（Mg2+ plus）5.0 μL；Ex Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O补足至50.0 μL。DNA序列分析：将测得的序列在NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）中进行相似性搜索，与已报道细菌菌株的16S rDNA序列进行同源性比较，并利用MEGA 5.2构建系统发育进化树。

1. 3 统计分析

试验数据采用Excel 2016进行处理，利用SPSS 20.0进行数据统计及差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 溶磷菌的促生特性分析结果

2. 1. 1 溶磷特性 通过初筛从长鞭红景天根际土壤中分离获得21株溶磷菌，将其进行活化培养，点接到无机磷培养基上，通过透明圈法测定菌株溶磷能力（Meena et al.，2015），结果（表1）表明，21株溶磷菌在无机磷培养基上培养9 d，其D/d为1.92～4.00，溶磷菌株的溶磷效果存在明显差异。将溶磷菌株接种于含Ca3（PO4）2的无机磷液体培养基中，利用钼锑抗比色法对培养基中可溶性磷进行定量测定，结果（表1）表明，21株菌株均具有溶解无机磷的能力，不同菌株的溶磷能力不同，其中溶磷量最小為52.75 μg/mL，最大为392.15 μg/mL。在21株溶磷菌株中以PSB19菌株的D/d和溶磷量最高，因此选取PSB19菌株作进一步研究。

2. 1. 2 PSB19菌株产IAA和固氮的定性测定结果

通过比色反应可看出，含100 mg/L色氨酸的培养液（图1-8～图1-10）较不含色氨酸培养液（图1-3～图1-5）的颜色变化更明显，分别呈紫红色和淡红色，与对照（图1-1）有明显差异，说明在金氏培养基中加入100 mg/L色氨酸能增加菌株IAA的分泌量。固氮特性测试结果（图2）显示，PSB19菌株在阿须贝无氮培养基中能正常生长，说明该菌株具有固氮能力。

2. 2 PSB19菌株低温适应特性检测结果

由图3可看出，PSB19菌株在4～30 ℃的条件下均能生长，但在20 ℃以下菌株生长有所延迟。4 ℃下，PSB19菌株与对照在生长前5 d无明显差异，培养5 d后PSB19菌株比对照生长迅速（图3-A）；10 ℃下，培养4 d后PSB19菌株生长速度高于对照（图3-B）；15和20 ℃下，PSB19菌株与对照的生长曲线相似，但PSB19菌株生长优于对照（图3-C和图3-E）；30 ℃下，PSB19菌株与对照菌株的生长曲线基本无差别，在经过短暂的延迟期后很快进入对数生长期。

2. 3 PSB19菌株鉴定结果

在LB培养基上，PSB19菌株的菌体呈杆状（图4），革兰氏染色呈阴性。PSB19菌株菌落呈乳白色、湿润、光滑，有黏液，边缘整齐（图5）。PSB19菌株对硝酸盐还原、过氧化氢酶、甘露醇、柠檬酸盐、淀粉水解和糖发酵作用呈阳性反应（表2）。根据16S rDNA测序结果与NCBI数据库BLAST比对结果，对PSB19菌株与参比菌株进行系统发育进化分析，并将序列提交NCBI数据库获得登录号为MF784286。从图6可看出，PSB19菌株与登录号为 KY753268.1的菌株（Ensifer adhaerens）处于同一分支，亲缘关系较近，同源性高达99%，综合形态观察、革兰氏染色及生理生化鉴定结果，将PSB19菌株暂定为粘着箭菌（E. adhaerens）。

3 讨论

磷是农业生产中一个重要的限制因素，而溶磷微生物干预似乎是解决土壤中磷有效性的有效途径。微生物溶磷主要是通过有机酸溶磷（席琳乔等，2007）、酶解作用（Zhu et al.，2011）和质子作用（李文红和施积炎，2006）溶解难溶性磷。本研究以溶磷圈法初筛、钼锑抗比色法复筛，得到多株具有较好溶磷作用的菌株，但菌株间的溶磷能力存在明显差异。有些菌的D/d虽然小，但其液体溶磷量并不小，说明菌株的溶磷能力不仅与时间有关，还与菌株代谢物的种类和代谢产物在基质中的蔓延程度等因素有关，因此，溶磷圈的大小并不与溶磷量完全呈正相关，与刘雪红等（2013）、赵龙飞等（2015）的研究结果一致。

温度是影响生物生长的重要因素，低温会对细胞膜、酶活性、DNA复制和细胞结构造成严重损坏（D'Amico et al.， 2006），但在生物进化过程中，低温微生物已形成了适应低温机制。青藏高原是生态环境最奇特、生物资源最丰富的自然资源宝库之一，在高海拔和低温的影响下，植物生长缓慢（李希来，2002）。本研究从长鞭红景天根际土壤中分离获得的PSB19菌株能在4和10 ℃的低温下良好生长，且该菌具有固氮和产IAA特性，使得该菌在高原环境下具有作为生物菌肥在农业生产及植被恢复等方面应用的潜力。

本研究通过形态、生理生化鉴定和16S rDNA分子生物学鉴定，确定PSB19菌株为粘着箭菌（E. adhaerens，登录号MF784286），该菌株与中华根瘤菌（Sinorhizobium）有较高的相似性。据前人对野生型粘着箭菌的研究结果表明，粘着箭菌不能在菜豆和银合欢上形成根瘤，但从热带根瘤菌（Rhizobium tropici）获得质粒后的菌株可形成根瘤，说明该菌不属于共生固氮菌类型（Rogel et al.，2001）。此外，该菌是否还具有其他促生作用，以及在高原条件下的最佳发酵条件和田间促生情况等均有待进一步探究。

4 结论

本研究从高海拔、高寒环境下生长良好的长鞭红景天根际土壤中分离得到21株具有溶磷作用的菌株，其中PSB19菌株有较好的溶磷、产IAA和固氮特性，且在低温下生长活跃，通过形态、生理生化特性和16S rDNA鉴定为粘着箭菌（E. adhaerens），该菌具有作为生物菌肥在农业生产及植被恢复等方面应用的潜力。

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（責任编辑 麻小燕）