青风藤正丁醇萃取物对肝癌细胞增殖影响的研究

雷欣睿 朱欣婷 刘云 叶萌 王文洪 李晓飞

摘 要：为验证青风藤正丁醇萃取物（BESA）体外抗肝癌活性，研究了BESA对人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721形态变化、细胞周期、细胞凋亡和细胞增殖的影响。结果显示BESA对HepG2、SMMC-7721肝癌细胞均有抑制作用，其半数抑制浓度（IC50）分别为 18.23 μg/mL，23.45 μg/mL，且呈剂量效应关系；经BESA处理后，HepG2细胞形态变化很大，细胞出现核皱缩、贴壁性差、细胞裂解等现象，以20 μg/mL的BESA处理HepG2细胞48 h后，流式细胞术检测到BESA对HepG2细胞周期的干预能力不强；但在诱发HepG2细胞发生凋亡方面效果明显，说明BESA能诱导HepG2细胞的凋亡达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。

关键词：青风藤；人肝癌细胞HepG2；人肝癌细胞SMMC-7721；抑制作用

中图分类号：R284.2

文献标识码： A

青风藤（Sinomenium acutum），又名清风藤、扶风藤、寻风藤，为防己科植物青藤sinomenium acutum（Thunb.）Rehd.et Wils.和毛青藤sinomenium scutum（Thunb.）Rehd.etWils.var.cinereum Rehd.et Wils.的干燥藤茎[1]。青风藤味苦性平，有祛风湿、通经络、利水止痛的功效，用于治疗风湿麻痹痛、关节肿痛、瘙痒、水肿、脚气等[2]。目前，对青风藤的研究集中于化学成分的分析及药理活性的研究[3]。青风藤的茎和根中富含的青藤碱是研究者重点研究的活性成分[4]，在降血压[5]、抗炎[6]、免疫抑制[7]、镇痛[8]等方面青藤碱具有良好的药理作用。课题组前期研究发现青风藤乙醇提取物具有良好的体外抑制肝癌HepG2细胞增殖的活性；调研更多的文献发现青风藤的主要成分——青藤碱对卵巢癌细胞[9]、胶质瘤细胞[10]、肾癌细胞[11]、乳腺癌细胞[12]等肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用。众所周知，中药是一个成分极其复杂的体系，所含的某些微量成分往往具有很强的生理活性；因此课题组拟开展青风藤可能含有的微量抗癌新化合物的挖掘工作。在接下来的研究工作中，课题组首先采用了极性由小至大的溶剂萃取策略。即利用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇对青风藤乙醇提取物依次萃取。再对各个萃取部位抑制肝癌HepG2细胞增殖的活性进行检测。实验结果发现青风藤正丁醇萃取物对肝癌细胞的抑制效果明显好于其他极性部位。因此，在本文中课题组将重点从细胞增殖、细胞形态变化、细胞周期、细胞凋亡四个方面对青风藤正丁醇萃取物的体外抗癌效应做出评价，为青风藤中微量抗癌新化合物的深度挖掘做前期准备工作。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；青风藤产地为四川，由医学与生物学研究中心宋长伟博士鉴定。

1.1.2 实验试剂

胎牛血清（以色列BI公司）；RPMI-1640 培养基、链霉素、青霉素（美国 Gibco 公司）；DMSO、胰蛋白酶、Tris（北京索莱宝科技有限公司）；磺酰罗丹明B（美国 Sigma 公司）；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、DNA含量（细胞周期）检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；其余试剂均为国产分析纯。96 孔板、6孔板、25 cm2培养瓶（美国康宁公司）。

1.1.3 实验仪器

SENCOR-201型旋转蒸发仪（上海中顺生物科技有限公司）；细胞培养箱（德国贺利氏公司），UR-4100型酶标仪（上海拜格生物科技发展有限公司），GTR21-1高速冷冻离心机（美国赛默飞公司）；倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术公司）；FACS Calibur 流式细胞仪（美国BD公司）；超纯水制备系统（美国密理博公司产品）。

1.2 实验方法

1.2.1 青风藤正丁醇萃取物的制备

青风藤全株风干、粉碎、过60目筛。称取粉末 100 g加1 L 95%乙醇，3 h回流提取两次，合并两次抽滤的提取液，减压浓缩去除溶剂。干燥后至恒重得青风藤醇提物，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇洗脱，收集各段洗脱液，浓缩。用SRB法对各萃取部位进行抗肿瘤活性的粗筛，发现青风藤正丁醇萃取物对肝癌HepG2、SMMC-7721細胞的增殖具有明显的抑制活性，故选取青风藤正丁醇萃取物（以下简称BESA）进行后续实验。称取正丁醇提取物10 mg，100 μL DMSO 溶解后，临用前用培养基稀释成所需浓度，室温保存。

1.2.2 肝癌细胞的培养

从液氮中取出冻存HepG2细胞的冻存管， 37 ℃的双蒸水快速解冻，然后取出置于含10%胎牛血清（内含青霉素 100 U/mL，链霉素 100 U/mL）的 RPMI-1640 完全培养基中。将培养瓶置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱培养，12 h后换液，待细胞长满培养瓶底部，弃培养液，PBS冲洗，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3传代培养，每日更换新鲜培养基。SMMC-7721细胞培养方法同上。

1.2.3 SRB法测定BESA对肝肿瘤细胞增殖的影响

取HepG2（或SMMC-7721）细胞，以200 μL 8000个/孔接种于96孔板中，每种细胞接种一块实验板（T）和一块对照板（T0）。培养 20 h 后，对照板每孔加入50 μL 4 ℃预冷的三氯乙酸（TCA）溶液；实验板换入200 μL 含BESA的培养基使其终浓度分别为 1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL，每种浓度设5个重复，另设置阴性对照组（C）和溶剂对照组，继续培养48 h加入50 μL 4℃预冷的TCA溶液，静置5 min移入4 ℃冰箱中固定1 h，取出用双蒸水冲洗5遍，室温晾干。每孔加入70 μL 0.4%的SRB染液，10 min后用1%醋酸冲洗5次，晾干后加入100 μL 10 mmol/L的缓冲Tris碱液溶解，在酶标仪上采用波长530 nm测吸光度值。按照下列公式计算肿瘤细胞生长抑制率。改良寇氏法计算半数抑制浓度（IC50），公式为

1.2.4 BESA对细胞形态的影响

将约长满培养瓶的HepG2细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，以1×104个/孔接种到24孔培养板中培养，24 h后，弃培养液。每孔分别加入含一定体积BESA的细胞培养基使其药物处理浓度分别为5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL，空白对照组加入对应体积的DMSO，每组设3个复孔。48 h后于倒置显微镜下观察HepG2细胞形态的变化情况并拍照。

1.2.5 细胞周期和细胞凋亡的检测

取HepG2细胞以2×104 个/瓶接种到六孔板中，培养24 h后，弃去培养液，加入含一定体积的BESA的细胞培养基使其药物处理终浓度分别为5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL，空白对照组加入对应体积的DMSO，每组设3个复孔。继续培养48 h。随后收集所有细胞，按照碧云天细胞周期或细胞凋亡试剂盒的使用说明进行待测样品的制备，最后上机检测。

1.2.6 统计学处理实验数据

采用 SPSS13.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BESA对肝癌细胞增殖的影响

BESA对肝癌SMMC-7721、HepG2细胞增殖的抑制作用如表 1 所示。BESA浓度分别为1.25、 2.5 μg/mL时，对两种细胞的抑制率较低；随着浓度的升高，其抑制作用也逐渐增强。当BESA浓度为40 μg/mL时，对SMMC-7721、HepG-2的抑制率分别为60.32%、58.59%。经改良寇氏法计算其IC50分别为18.23、23.45 μg/mL。

2.2 BESA对人肝癌细胞HepG2形态的影响

由表1可知，本实验中BESA对肝癌HepG2细胞增殖的抑制效果较好，因此选取肝癌HepG2细胞进行后续实验，继续考察BESA对HepG2肝癌细胞的作用。如图1所示，空白对照组细胞生长正常，接近于长满培养皿；终浓度为10 μg/mL的BESA作用48 h后，细胞变圆且突起，细胞数目减少，细胞与邻近细胞分离，贴壁能力下降，形态异常的细胞增多。当作用浓度提高到20 μg/mL时，细胞密度显著减小，细胞形态不规则，出现细胞核皱缩的现象，显示出很强的抑制作用。

2.3 BESA对HepG2细胞周期分布的影响

终浓度为5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL的BESA作用于HepG2细胞48 h后，检测其细胞周期变化，结果见表2。给药后G0/G1期细胞数下降，S期的细胞数增加，G2/M期细胞数也略有增加，综合来看BESA对HepG2细胞周期分布的影响不大。

2.4 BESA对HepG2细胞凋亡的影响

终浓度为5、10、20 μg/mL（IC50）的BESA作用于肝癌HepG2细胞48 h后，检测其细胞凋亡的变化情况，结果如图2所示：与未给药的对照组比较，BESA能诱导肝癌HepG2细胞发生早期凋亡，凋亡现象明显；且诱发凋亡的程度与剂量呈正相关关系。

3 讨论

原发性肝癌是一种常见恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤的第三位[13]。青风藤原本是一味用于治疗风湿性及类风湿性关节炎的传统民间中药，但现代药理学研究发现其主要成分——青藤碱具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的生理活性[14-15]。由于中药是一个多成分多靶点的复杂体系，某些未知微量成分往往具有更强的生理活性[16-17]；课题组认为青风藤中极有可能含有活性更强的新化合物，开展青风藤微量抗癌新化合物的挖掘工作非常有意义。

实现上述目标的前提是从多个角度确认青风藤活性部位是否具有明确的抑癌效应。在前期的研究中，课题组采用SRB法对其抗肿瘤活性的有效部位进行了初筛，发现青风藤乙醇提取物的正丁醇萃取部分对肝癌细胞的增殖有较强的抑制作用。本实验首先以人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721为研究对象，发现BESA对人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721的抑制作用呈剂量效应关系，其IC50分别为18.23 μg/mL和23.45 μg/mL。由IC50可知，BESA對人肝癌细胞株HepG2的抑制作用较强。因此，在后续实验中又以HepG2细胞为重点实验对象，通过显微镜观察发现，经BESA作用后的HepG2细胞出现细胞核皱缩、细胞贴壁性差、细胞裂解等现象。

由于肿瘤的发生常与细胞的异常增殖有密切的关系，肿瘤细胞的周期阻滞剂可能成为抑制癌症的有效物质[18]；青风藤中是否含有此类造成细胞周期阻滞的物质呢？为了回答这个问题，本研究考察了BESA对HepG2细胞周期的影响，实验结果提示BESA对肝癌HepG2细胞周期干预的能力较弱。在接下来的实验中，我们检测了BESA诱导肝癌HepG2细胞凋亡的能力，实验结果显示20 μg/mL浓度的BESA就能造成10%以上的HepG2细胞发生早期凋亡，BESA诱发细胞凋亡的能力非常强；提示：BESA中含有诱导肿瘤细胞凋亡的物质，值得进一步深度挖掘。基于本文的研究结果，在后续研究中课题组将利用现代色谱技术对青风藤正丁醇萃取物中所含有的微量成分进行分离纯化，再辅以现代波谱分析技术进一步确定活性化合物的结构，为合理利用青风藤这一传统中药材，以及后期的新药创制提供实验依据。

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（责任编辑：江 龙）