金佛山方竹林下大型真菌的鉴定

姚刘斌 骆礼华 江龙

摘 要：从贵州省遵义市赤水县、正安县金佛山方竹林地采集到大型真菌，經形态学鉴定出7科8属13种，用分子生物学方法鉴定出其中5种，分别是黄方孢粉褶菌Entoloma murrayi、橙黄乳菇Lactarius aurantiacus、红菇Russula lepida、乳牛肝菌Suillus bovinus、红汁乳菇Lactarius hatsudake。

关键词：金佛山方竹；外生菌根真菌；形态学鉴定；分子生物学鉴定

中图分类号：Q-9

文献标识码： A

金佛山方竹（Chimono bambusa utilis（Keng）Keng f.）是大娄山特有物种，仅分布于海拔1300 m以上雨雾大、湿度大、气候寒冷的高山，与常绿阔叶树组成复层混交林，可涵养水源、保持水土、调节区域气候[1]。其用途广泛，可用于建材、造纸等，方竹笋营养丰富、风味独特[2]，经济价值高[3]。由于立竹密度过大、年龄结构不合理和竹-木结构比例失调等，导致金佛山方竹在实际生产中“三低” （低产、低质、低效）问题突出，病虫害发生严重，如何改善方竹笋生长状况，提高产量，改善品质的是金佛山方竹生产中的关键问题。大型真菌，特别是外生菌根真菌与植物根系形成的共生体，能有效改善宿主植物的营养状况，提高抗逆性，促进宿主植物生长，提高产量、改善品质[4-9]，通过接种适宜真菌来解决金佛山方竹生产中的“三低”问题，这是一条潜在的有效方法，所以摸清金佛山方竹中共生真菌的资源状况尤显重要。

以金佛山方竹主要分布地贵州省正安县、赤水县为采样地，采集大型真菌，根据子实体颜色、形状、大小等形态学指标结合分子生物学ITS区序列的系统发育分析方法进行物种鉴定，以期为金佛山方竹生产提供菌种资源。

1 样品的采集与处理

采样地位于贵州省正安县新州镇、赤水县大同镇的金佛山方竹林，海拔1300～1600 m。采样时，首先用相机拍下其生境，除去子实体表面的泥土和落叶，编号装入采样袋中，放入低温采样箱，尽快带回贵州大学植物生理实验室4 ℃冰箱保存，保藏时间不超过一周。

2 形态学鉴定

根据真菌菌盖的大小、颜色、形状，菌褶的颜色、稀密，菌柄的长度、直径、形状等形态学指标，结合野外拍摄的彩色照片及采样记录，参考相关的工具书对其进行形态学鉴定[10-14]。

3 ITS区序列的系统发育分析

DNA的提取采用biomiga公司的真菌基因组DNA提取试剂盒，操作步骤严格按照试剂盒步骤进行。

采用ITS1和ITS4引物来扩增真菌的rDNA ITS序列。PCR反应体系：采用25 uL体系，包括有正反向引物各1 uL，DNA模板1 uL，2×PCR Master Mix（含2×Taq DNA polymerase，2×PCR Buffer，2×dNTP）12.5 uL，用ddH2O补至25 uL。扩增反应在PCR仪上进行。扩增程序具体参数如下：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环，72 ℃延伸5 min，于4 ℃保存。用纯化后的PCR扩增产物和引物直接测序。测序由上海生工生物工程有限公司进行测序。

4 结果与分析

4.1 形态特征

根据形态学指标对采集的大型真菌进行鉴定，共有9科12属18种（见图1），其中外生菌根真菌7科8属13种，形态学特征如下：

黄方孢粉褶菌Entoloma murrayi（图1 1～2），粉褶菌科粉褶菌属，外生菌根真菌。

菌盖斗笠型，黄色，宽2.1～4.4 cm，表面光滑发亮，中间有一明显的尖状突起；菌肉薄，淡黄色；菌褶离生，淡黄色，密，不等长；菌柄中生，棍状，长4.6～9.0 cm，黄色，中空。

子实体散生，生于阔叶林或竹林地上。

赭红方孢粉褶菌Entoloma quadratum（图1 3～4），粉褶菌科粉褶菌属，外生菌根真菌。

菌盖伞形，宽2～3.5 cm，边缘为锯齿状，表面光滑，黄褐色；菌肉黄色，薄；菌褶直生，棕黄色，不等长；菌柄中生，长4.2～7.8 cm，粗0.2～1.0 cm，黄色，中空。

子实体散生，生于阔叶林或竹林地上。

网纹马勃Lycoperdon perlatum（图1 5～6），马勃菌科马勃菌属，外生菌根真菌。

子实体倒卵形，高2.4～5 cm，初期白色，后变为黄色直至棕灰色，外表面被由无数细微小疣组成，间有较大易脱的剌。子实体单生或散生于竹林中地上。

朱红湿伞Hygrocybe miniata（见图1 7～8），蜡伞科蜡伞属，外生菌根真菌。

菌盖扁平半球形，红色，表面光滑，蜡质，宽2～3cm；菌肉薄，淡黄色；菌褶米黄色，稀疏，不等长；菌柄红色，带有点橙色，光滑，中空。子实体散生，生于阔叶林中地上。

变黑湿伞Hygrocybe nigrescens（图1 9～10），蜡伞科蜡伞属，外生菌根真菌。

菌盖斗笠形，黑色，宽2.6～3 cm，边缘开裂；菌肉黑色，薄；菌褶白色，密；菌柄长4.2～4.6 cm，粗0.6～0.8 cm，中空。子实体散生，生于针叶林或阔叶林中地上。

蜡伞Hygrocybe ceraceus（图1 11～12），蜡伞科蜡伞属，外生菌根真菌。

菌盖扁平，淡黄色，直径2～4 cm，表面光滑，蜡质，脆；菌肉薄，淡黄色；菌褶直生，稀疏，浅黄色，不等长；菌柄中生，长3～5 cm，粗0.5～0.7 cm，淡黄色，中空。子实体单生，生于林下苔藓植物间。

桃红色胶鸡油菌Gloeocantharellus persicinus（图1 13～14），钉菇科粘鸡油菌属。

菌盖初期半球形后平展，橙红色，宽3.8～7 cm，边缘波状；菌肉白色；菌褶直生，白色，密，不等长；菌柄偏生，长4～5.5 cm，粗0.9～1.5 cm，白带粉红色，与菌盖颜色相近，中空。子实体散生，生于林中地上。

冠锁瑚菌Clavulina cristata（图1 15～16），珊瑚菌科锁瑚菌属。

多枝，白色，近球形，高3～7 cm，表面光滑；菌肉白色，内实。子实体群生，生于阔叶或针叶林中地上。

怡人拟锁瑚菌Clavulinopsis amoena（图1 17～18），珊瑚菌科拟锁瑚菌属

表面光滑，淡黄色至橙黄色，高3～10 cm，粗0.2～0.6 cm，棍棒状，顶端尖锐，中空。子实体群生，生于阔叶或针叶林中地上。

金肉桂拟锁瑚菌Clavulinopsis aurantiocinnabarina（图1 19～20），珊瑚菌科拟锁瑚菌属。

子实体不分支或少许分支，高5.2～15.4 cm，橘红色，中空；菌肉为黄褐色。子实体群生，阔叶或针叶林中地上。

红蜡蘑laccaria laccata（图1 21～22），白蘑科蜡蘑属，外生菌根真菌。

菌盖平展，中央有一颜色较深凸起，宽2.8 cm，红棕色，表面光滑；菌肉与菌盖同色，薄；菌褶黄棕色，稀疏；菌柄中生，长5.6 cm，粗0.26 cm，纤维质，实心。子实体散生，生于针叶林或阔叶林中地上。

竹林拟口蘑Tricholoma ionides（图1 23～24），白蘑科拟口蘑属。

菌盖伞形至平展，直径4.1～6.6 cm，，黄褐色，表面密被鳞片，盖中央为黑褐色；菌肉淡黄色；菌褶近直生，白色，密；菌柄中生，长3～4.6 cm，粗0.6～0.8 cm，圆柱形，中空。子实体散生，生于有较厚的竹叶落叶层的竹和阔叶树的混交林下。

乳牛肝菌Suillus bovinus（图1 25～26），乳牛肝菌科乳牛肝菌属，外生菌根真菌。

菌盖半球形至扁平，宽3.8～5.5 cm，土黄色，湿时较黏；菌肉淡黄色；菌管淡黄褐色；管孔复式，大，呈辐射状排列，孔径约1 mm；菌柄长3.5～5.6 cm，粗0.8～1.2 cm，近圆柱状。

生态习性：子实体散生或群生，生于松林及其他针叶林中地上。

小鸡油菌Cantharellus cibarius（图1 27～28），鸡油菌科鸡油菌属，外生菌根真菌。

子实体小，肉质，呈喇叭形，宽2.6 cm，鸡油黄色，表面光滑；菌肉浅黄色，较厚；菌褶延生，淡黄色，稀疏；菌柄长4.6 cm，粗0.8 cm，浅黄色。子实体散生，生于阔叶林中地上。

橙黄乳菇Lactarius aurantiacus（图1 29～30），红菇科乳菇属，外生菌根真菌。

菌盖平展，中间下凹，宽4.2 cm，橙红色，表面光滑；菌肉结实，气味弱，有白色乳汁；菌褶延生，黄棕色，密；菌柄中生，长3.4 cm，粗0.8 cm，黄棕色，柱形，中空。子实体群生，生于针叶林或阔叶林中地上。

红汁乳菇Lactarius hatsudake（图1 31～32），红菇科乳菇属，外生菌根真菌。

菌盖扁平状，中间下凹，宽7.6 cm，黄色；菌肉黄色，受伤后渐变为黄绿色；菌褶延生，黄色，密；菌柄中生，长2.6 cm，粗1.1 cm，黄色，中空。子实体单生，生于针叶林阔叶林中地上。

红菇Russula lepida（图1 33～34），红菇科红菇属，外生菌根真菌。

菌盖平展，中央微凹，宽7.2 cm，红色，湿是表面有点黏，表皮易撕下；菌肉白色；菌褶直生，白色，等长；菌柄中生，长3.5 cm，粗1.4 cm，圆柱形，白色，中实。子实体单生，生于针叶林阔叶林中地上。

变绿红菇Russula virescens（图1 35～36），紅菇科红菇属，外生菌根真菌。

菌盖平展，中央微凹，宽7.3 cm，浅绿色，表皮龟裂形成不规则的块状小斑；菌肉白色，质脆；菌褶直生，白色，等长，密；菌柄中生，长5.6 cm，粗1.7 cm，圆柱形，白色，内部海绵质。子实体单生，生于针叶林或阔叶林中地上。

4.2 5种外生菌根真菌的ITS区序列的系统发育分析

采用ITS1和ITS4引物来扩增6（黄方孢粉褶菌）、79（橙黄乳菇）、M2（红菇）、M3（乳牛肝菌）、M10（红汁乳菇）的rDNA ITS序列，测序结果如下：

所得的序列运用GenBank的序列局部相似性查询系统，在GenBank数据库下载与所测DNA序列相似的序列，建立系统发育树，可分为4个聚类群（见图2）， 79，M10在分类群Lactarius，M2在分类群Russula，M3在分类群Suillus，6在分类群Entoloma。并且这5种外生菌根真菌的分子鉴定与形态鉴定一致，分别是：6为黄方孢粉褶菌Entoloma murrayi，79为橙黄乳菇Lactarius aurantiacus，M2为红菇Russula lepida，M3为乳牛肝菌Suillus bovinus，M10为红汁乳菇Lactarius hatsudake。

5 讨论

本研究通过在金佛山方竹林中采集大型真菌标本，通过形态学观察对金佛山方竹林地中部分大型真菌进行鉴定，共鉴定出12属18种，其中包括外生菌根真菌8属13种。结合分子生物学鉴定外生菌根真菌得到5种外生菌根真菌与形态学鉴定相一致，分别为黄方孢粉褶菌Entoloma murrayi、橙黄乳菇Lactarius aurantiacus、红菇Russula lepida、乳牛肝菌Suillus bovinus、红汁乳菇Lactarius hatsudake。结合初步调查显示[15]，证明了金佛山方竹可与外生菌根真菌形成菌根结构，金佛山方竹林地中拥有着丰富的外生菌根真菌资源，为外生菌根真菌在金佛山方竹上的应用提供了菌种资源。

外生菌根真菌在生态系统上有着不容忽视的作用，研究表明，外生菌根真菌对岩石和矿物的风化作用可对生态系统的物质循坏过程产生影响，并提高土壤养分的生物有效性[16]。接种外生菌根真菌形成共生结构，可以提高植物成活率，促进植物生长[17-19]。张扬等人将外生菌根真菌接种到湿地松上，证明接种后能提高湿地松成活率，显著地促进湿地松生长[20]。马琼将外生菌根真菌接种到马尾松幼苗，证明接种后幼苗的生长、菌根侵染率和氮磷钾含量均优于对照[21]。外生菌根真菌通过影响植物根系活力、根系质膜相对透性、提高硝酸酶活性、增加叶绿素含量等方式，使地上与地下部分协同作用，促进植物生长[22]。外生菌根真菌对于金佛山方竹育苗、造林、改善生态系统等方面具有重要意义[23]，。因此接种外生菌根真菌在金佛山方竹上来提高其移植率、产量、品质等具有广阔的前景。

参考文献：

[1]郑翼，罗吉斌.金佛山方竹育苗与造竹技术[J].林业科技开发，2008（03）：115-116.

[2]张喜，龙志永，许才万，等.金佛山方竹不同密度人工林笋产量研究[J].世界竹藤通讯，2013（11）： 16-20.

[3]李曙明，张佐玉，杜凌，等.金佛山方竹低产林改造技术[J].林业实用技术，2008（5）：20-22.

[4]樊永军，闫伟.内蒙古地区白桦外生菌根形态类型及分子鉴定[J].西北植物学报，2013，33（11）：2209-2215.

[5]王志勇，李晓宏，胡博.外生菌根菌的研究进展[J].湖北林业科技，2005（03）：42-45.

[6]叶文兰，骆礼华，江龙. 金佛山方竹根围丛枝菌根真菌的初步研究[J]. 山地农业生物学报，2017，36（2）：25-30.

[7]叶文兰，骆礼华，严璐，等. 金佛山方竹根际土壤中优势AM真菌的鉴定[J]. 竹子学报，2017，36（2）：36-43.

[8]于萌，崔明，申鸿，黄建国.外生菌根真菌对油松幼苗生长的影响[J].四川林业科技，2011，32（02）：45-48.

[9]陈永锋.金佛山方竹的育苗技术[J].世界竹藤通讯，2008（04）：24-26.

[10]袁腾，陶光耀，江龙. 梵净山4种林型土壤丛枝菌根真菌多样性[J]. 东北林业大学学报，2018，46（3）：83-86.

[11]温祝桂，陈亚华.中国外生菌根真菌研究进展[J].生物技术通报，2013（02）：22-30.

[12]吴兴亮.中国梵净山大型真菌[M].北京：科学出版社，2014.

[13]黄年来.中国大型真菌原色图鉴[M]北京：中国农业出版社，1998.

[14]吴兴亮.中国热带真菌[M].北京：科学出版社，2010.

[15]严璐，姚刘斌，江龙.竹林外生菌根真菌资源的初步调查[J].贵州大学学报（自然科学版），2017，34（02）：21-25.

[16]魏松坡，贾黎明.外生菌根真菌对矿物风化作用研究进展[J].生态学杂志，2014，33（12）：3447-3454.

[17]阎秀峰，王琴.接种外生菌根对辽东栎幼苗生长的影响[J].植物生态学报，2002（06）：701-707.

[18]宋瑞清，鞠洪波，祁金玉，周博如.外生菌根菌对樟子松苗木生长的影响[J].菌物研究，2007（03）：142-145.

[19]Ying Long Chen，Bernard Dell，Nicholas Malajczuk. Effect of Scleroderma Spore Density and Age on Mycorrhiza Formation and Growth of Containerized Eucalyptus globulus and E. urophylla Seedlings [J]. New Forests，2006，31（3）.

[20]張扬，曾丽琼，叶建仁，吴小芹，张林平.接种外生菌根真菌对湿地松林促生效应及根际微生物数量的影响[J].南京林业大学学报（自然科学版），2014，38（05）：57-61.

[21]马琼，黄建国，蒋剑波.接种外生菌根真菌对马尾松幼苗生长的影响[J].福建林业科技，2005（02）：85-88.

[22]陈桂梅.油松菌根伴生真菌与外生菌根真菌的互作研究[D].西北农林科技大学，2009.

[23]张茹琴，唐明，张海涵，杜小刚.秦岭火地塘林区外生菌根真菌的初步调查[J].青岛农业大学学报（自然科学版），2011，28（03）：168-173.

（责任编辑：曾 晶）