高分辨率熔解曲线技术检测非小细胞肺癌患者胸水中EGFR基因突变

谈云，　陈姝颖，　汤俊明，　乔国洪，　何超，　毛旭华

肺癌是发病率较高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占80%，大部分患者发现时已处中晚期[1-2]。目前，以表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)为代表的分子靶向药物治疗是晚期NSCLC有效且低毒性的治疗方法。而体细胞EGFR基因突变是对EGFR-TKI靶向治疗是否有效的主要依据。高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)是2003年出现的一种基因序列分析技术，具有闭管操作不易污染，检测快速、准确、成本低廉等优点[3]。我们采用HRM法对NSCLC患者胸水中EGFR基因突变进行检测研究，探讨该方法临床应用价值。

1　资料与方法

1.1标本收集

收集2015年1月至2016年11月，江苏大学附属宜兴市人民医院经细胞学检查确诊为NSCLC的30例患者胸水作为研究对象，其中男13例，女17例，年龄38～72岁，中位年龄62岁。

1.2实验方法

1.2.1DNA制备取30 ml胸水，3 000 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞沉淀，保存于-80 ℃备用。选用Omega Blood DNA Kit D3392血液DNA提取试剂盒(美国Omega Biotek公司)提取细胞沉淀DNA，并进行DNA纯度及浓度检测。

1.2.2高分辨率熔解曲线法引物设计及反应体系与反应条件HRM法引物设计见表1。HRM法检测仪器采用Roche LightCycler 480 system(瑞士罗氏公司)。总反应体积为20 μl，其中包括Light Cycler HRM Master Reaction Mix(瑞士罗氏公司)， 200 nmol/L引物，3 mmol/L MgCl2和样品DNA模板。HRM法反应条件为：95 ℃预变性10 min，然后95 ℃变性10 s，65 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，45个循环(采用touch down技术，前10个循环退火温度从65 ℃降到55 ℃，每个循环降1 ℃)。扩增结束后直接进行HRM分析，反应条件为95 ℃1 min，40 ℃1 min，熔解曲线数据收集从70 ℃到95 ℃，温度上升速率为1 ℃/s，40 ℃冷却[4-5]。

表1　HRM法引物

1.3检测方法

所有检测标本均同时用HRM法与Sanger测序法进行检测，对两种方法检测结果进行对比分析。分析敏感性和特异性。

2　结果

2.1EGFR基因突变检测结果

HRM法检测EGFR基因18至21外显子突变总检出率为26.67%(8/30)，18至21外显子突变检出例数分别为1例、4例、0例、3例。Sanger测序法检测总检出率为23.33%(7/30)，其中18外显子检出G719C突变1例，19外显子检出缺失突变3例，20外显子未检出突变，21外显子检出L858R突变3例，见表2。图1为实验中选取的HRM法突变示意图，图2～4为测序法典型突变示意图。

表2　HRM法和Sanger测序法检测EGFR基因突变结果统计

图1　HRM法检测EGFR基因突变示意图

图2　EGFR基因18外显子G719C突变

图3　EGFR基因19外显子缺失突变

图4　EGFR基因21外显子L858R突变

2.2HRM法特异性和敏感性

HRM法与Sanger测序法相比，敏感性为100%，特异性为95.83%。阳性预测值为88.89%，阴性预测值为100%。HRM法与“金标准”Sanger测序法相比，敏感性与特异性均符合临床检测要求。

3　讨论

表皮生长因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性。它能调节肿瘤细胞的生长、侵袭、转化、血管生成及转移[4，6]。EGFR基因突变是患者是否对酪氨酸激酶抑制剂敏感的强预测因子[7]。EGFR基因突变主要发生在 18至21外显子上[8]。因此，对EGFR基因18至21外显子基因突变的检测可为NSCLC患者靶向治疗提供重要依据。

传统EGFR基因检测标本通常来自手术组织样本，在实际临床检测中，常无法获取肿瘤组织标本。如大部分NSCLC患者在首诊时已失去手术治疗的机会，无法获取手术组织样本，或者既往虽有手术病史，但石蜡标本历时太久，无法进行基因检测等。肺穿刺及支气管镜检查等方式获取的组织是EGFR基因检测标本的另一来源，通常这些标本组织含量较少，混合大量杂质，增加了EGFR基因检测的难度。因此，寻找组织标本的良好替代物及检测方法极为重要。有研究表明，胸腔积液和血液可作为基因检测新途径[9-10]。

目前，Sanger测序法和ARMS法是临床检测EGFR基因突变的主要方法。作为基因检测“金标准”的Sanger测序法，其检测灵敏度有限，10 ng基因组条件下突变含量要达到20%的DNA样本才可准确检测。因此对于肿瘤组织DNA含量低，基因突变比例低的样本，采用Sanger测序法易产生假阴性。同时Sanger测序法操作繁琐，反复开盖易污染，检测周期需3 d。ARMS法操作简便仅1 d即可完成，检测灵敏度达1%，但目前使用的商用检测试剂盒价格昂贵。HRM技术由PCR扩增技术与熔解曲线分析技术相结合。原理是扩增含突变位点基因的过程中，由于突变位点不匹配会导致双链DNA在升温过程中先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可判断是否存在突变位点[4]。HRM技术具有操作简单，闭管操作不易污染，检测快速仅需1 d、成本低于商用检测试剂盒[3]。文献报道，HRM技术理论检测限为5%[3，11]，灵敏度高于直接测序法。但HRM技术只能对已知突变进行检测，并且只能检出有无突变而无法确定具体突变类型。对于EGFR基因，前期已有大量研究，未知突变极少，通过引物设计优化，HRM技术的局限性对临床检测影响较小。

本研究显示，HRM法突变检出率(26.67%)略高于Sanger测序法(23.33%)。因胸水中肿瘤细胞含量的不确定性，所以临床检测中需要高灵敏度的检测方法，已初步体现出HRM法灵敏度高的优势。文献报道，EGFR基因突变率为36.4%～66.3%[12]。本研究突变检出率低于文献报道，推测可能是NSCLC患者胸水中肿瘤细胞含量及肿瘤细胞中EGFR基因突变的比例过低，低于HRM法的检测下限而导致假阴性，或者是由于样本量小，具体原因还需进一步研究。本研究中EGFR基因突变集中在19外显子和21外显子突变，与其他学者[13-15]研究一致。由于样本量较小，未能检测到EGFR基因20外显子突变。总之，HRM技术灵敏度高，快速，准确，廉价，闭管操作等，适用于检测NSCLC患者胸水中EGFR基因突变。