轮叶党参粗多糖对体外培养小鼠脾淋巴细胞 及RAW 264.7细胞的免疫活性

张 妍,邵玉健,黄 睿,林昌岫,康东周,*

(1.延边大学 药学院,吉林延吉 133002;2.延边大学附属医院中心实验室,吉林延吉133000)

轮叶党参(Codonopsislanceolata)又名山胡萝卜、山地瓜、羊乳等,为桔梗科党参属药用植物,以根入药,是长白山珍贵的药食两用的植物[1]。我国传统医学认为轮叶党参可以强身壮力、补虚润肺、通乳排脓、解毒疗疮的功效[2],而据现代医学研究,轮叶党参具有抗痨病、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、抗突变等作用[3]。

植物多糖是从天然植物中提取的一种具有生物活性的物质,经研究发现,许多植物多糖都具有提高机体免疫功能的作用,并进行了深入地研究,而轮叶党参粗多糖对机体免疫机能方面研究却鲜少有报道。所以,研究轮叶党参粗多糖相关免疫调节作用对于轮叶党参保健功能的开发具有很大的意义。

本文旨在研究轮叶党参粗多糖对小鼠脾淋巴细胞特异性免疫功能及RAW 264.7作用下非特异性免疫功能的影响,为轮叶党参粗多糖的开发和利用建立基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

轮叶党参 经延边大学药物分析教研室康东周副教授鉴定为长白山道地药材轮叶党参。6～8周龄BALB/C小鼠 延边大学动物实验中心;RAW 264.7 武汉普诺赛生命科技有限公司;胎牛血清、青链霉素双抗、胰蛋白酶 美国Hyclong公司;RPMI-1640培养基 赛默飞世尔生物化学制品有限公司;MTT、DMSO、磷酸盐缓冲溶液 北京索莱宝公司;小鼠细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒 美国BD公司;LPS、NEDD、Sulfanilamide、ConA 美国sigma公司;RT-PCR试剂盒 Promega公司。

酶联免疫检测仪 美国伯腾仪器有限公司;二氧化碳培养箱 Thermo公司;低温高速离心机 BECKMAN公司;倒置显微镜 Olympus公司;超净工作台 BIOAIR公司;PCR仪 BIO-RAD公司;凝胶成像仪 Proteinsimple公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠脾脏细胞制备 脱颈处死BALB/C小鼠,于75%乙醇中完全浸泡2 min,在无菌环境下取出小鼠脾脏,将脾脏置于200目铜筛上边研磨边用RPMI-1640培养基冲洗过滤,收集滤液于4 ℃ 1000 r/min离心后弃上清,再用RPMI-1640培养基冲洗、吹打,自离心至吹打如此过程重复三次即得小鼠脾脏细胞[4]。

1.2.2 轮叶党参粗多糖及溶液的制备 采用水提醇沉法,料液比为1∶10,水提温度80 ℃,浸提3 h,40 ℃浓缩,加入乙醇至乙醇终浓度为65%[5]。醇沉后,丙酮、乙醚洗涤沉淀,用Savage法除蛋白[6],经冷冻干燥得轮叶党参粗多糖。将轮叶党参粉末按相应浓度溶于含10% FBS RPMI-1640培养基中,无菌环境用0.3 μm滤膜过滤。

1.2.3 脾淋巴细胞分组与培养

1.2.3.1 实验分组 正常组(只含细胞),阳性对照组(ConA终浓度为5 μg/mL),用药组(ConA+轮叶党参粗多糖,ConA终浓度为5 μg/mL,多糖终浓度分别为1000、500、250、125 μg/mL,用药组各含5 μL/mL ConA)。

1.2.3.2 ELISA法检测IL-2、IFN-γ分泌水平 将刚分离的小鼠脾脏细胞以2.5×106个/孔接种于48孔(终体积为400 μL)细胞培养板中,培养4 h后,按分组给药,置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养72 h,用ELISA法检测细胞上清液中IL-2,IFN-γ浓度。

1.2.4 RAW 264.7分组与培养

1.2.4.1 实验分组 正常组(只含细胞),阳性对照组(LPS终浓度为2 μg/mL),用药组(轮叶党参粗多糖终浓度为1000、500、250、125 μg/mL)。

1.2.4.2 RAW 264.7 的细胞增殖活性测定 将RAW 264.7以1×104个/孔接种于96孔(终体积为200 μL)细胞培养板中,培养4 h后,按分组给药,置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养24 h。加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)培养箱孵育4 h后,吸出细胞上清,每孔加入100 μL DMSO溶解,在570 nm波长处测定吸光度。

细胞相对增殖率(%)=(实验组吸光度值/空白对照组吸光度值)×100

1.2.4.3 ELISA法检测TNF-α、IL-6水平 将RAW 264.7细胞以2.5×105个/孔接种于48孔(终体积为400 μL)细胞培养板中,培养4 h后,按分组给药,置于37 ℃,5%CO2培养箱中培养48 h,收集细胞上清液用ELISA法检测细胞上清液中IL-2、IFN-γ浓度。

1.2.4.5 RT-PCR法检测iNOS mRNA的表达 将RAW 264.7细胞以2×106个/孔接种于48孔(终体积为400 μL)细胞培养板中,培养4 h后,分组给药,剂量组质量浓度为1000 μg/mL,置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养24 h,弃上清。mRNA的提取,RNA逆转录与cDNA合成的方法均按照试剂盒说明书进行。引物序列β-actin:反义:5′-CAGGTCCCGG CCAGCCAGGT -3′;正义:5′-CACCCGCCACCAG TTCGCCA-3′;iNOS:反义:5′-CTCCTTTGAGCCC TTTGT -3′;正义:5′-GAGCGAGTTGTGGATTGTC-3′。按照以下参数进行PCR 扩增反应:β-actin:先 95 ℃ 预变性5 min,然后95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,30个循环,最后一个循环72 ℃ 7 min。iNOS:先95 ℃预变性5 min,然后95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,35个循环,最后一个循环72 ℃ 7 min。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 轮叶党参粗多糖对脾淋巴细胞IL-2生成量的影响

不同浓度的轮叶党参粗多糖和5 μg/mL ConA作用于脾淋巴细胞后,IL-2生成量极显著高于正常组(只含细胞)与阳性对照组(ConA组)(p<0.01),见表1。ConA具有刺激脾淋巴细胞增殖的作用,使得在阳性对照组中ConA的作用下,IL-2浓度极显著高于正常组(p<0.01)。而在剂量组中,与阳性对照组相比,IL-2浓度随着剂量的加大而增加。表明在剂量为125～1000 μg/mL范围内,轮叶党参粗多糖可以发挥协同作用,极显著促进ConA诱导的脾淋巴细胞分泌IL-2(p<0.01)。

表1 轮叶党参粗多糖对脾淋巴细胞 分泌IL-2的影响Table 1 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on IL-2 production by mouse spleen

2.2 轮叶党参粗多糖对脾淋巴细胞IFN-γ生成量的影响

不同浓度的轮叶党参粗多糖和5 μg/mL的ConA作用于脾淋巴细胞后,IFN-γ生成量极显著高于正常组与阳性对照组(ConA组)(p<0.01),见表2。ConA具有刺激脾淋巴细胞增殖的作用,使得在阳性对照组中ConA的作用下,IFN-γ浓度极显著高于正常组。而在各剂量组中,与阳性对照组相比,IFN-γ浓度随着剂量的加大而增加。表明在剂量为125～1000 μg/mL范围内,轮叶党参粗多糖可以发挥协同作用,极显著促进ConA诱导的脾淋巴细胞分泌IFN-γ(p<0.01)。

表2 轮叶党参粗多糖对脾淋巴细胞分泌 IFN-γ的影响Table 2 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on IFN-γ production by mouse spleen

2.3 轮叶党参粗多糖对RAW 264.7细胞的增殖的影响

由表3可得,不同浓度的轮叶党参粗多糖对RAW 264.7细胞与正常组比较增殖作用显著(p<0.05)。剂量浓度为125～1000 μg/mL时,均显著有细胞增殖能力。当剂量浓度为250或500 μg/mL时,其增殖效果相近。而浓度为1000 μg/mL时,促进细胞增殖能力最大。

表3 轮叶党参粗多糖对RAW 264.7细胞的 增殖的影响Table 3 Proliferation effect of Codonopsis lanceolata polysaccharide on cultured RAW

2.4 轮叶党参粗多糖对RAW 264.7 TNF-α、IL-6生成量的影响

由表4、表5可得,不同浓度的轮叶党参粗多糖作用于RAW 264.7细胞后,TNF-α,IL-6浓度极显著高于正常组(p<0.01)。可见在剂量浓度在125～1000 μg/mL范围内时,TNF-α,IL-6分泌量增加效果明显,甚至高于LPS组。当多糖质量浓度为 1000 μg/mL时,TNF-α,IL-6生成量最大。

表4 轮叶党参粗多糖对RAW 264.7 分泌TNF-α的影响Table 4 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on TNF-α production by RAW

表5 轮叶党参粗多糖对RAW 264.7 分泌IL-6的影响Table 5 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on IL-6 production by RAW

2.5 轮叶党参粗多糖对RAW 264.7 NO生成量的影响

由表6可得,不同浓度的轮叶党参粗多糖作用于RAW 264.7细胞后,NO生成量极显著高于正常组(p<0.01)。可见在剂量浓度在125～1000 μg/mL范围内时,NO分泌量增加明显,甚至高于LPS组,且随着浓度剂量增加而增多。当多糖质量浓度为 1000 μg/mL时,NO生成量最大,作用最显著。

表6 轮叶党参粗多糖对RAW 264.7 分泌NO的影响Table 6 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on NO production by RAW

2.6 轮叶党参粗多糖对RAW 264.7 iNOS mRNA表达的影响

由图1可知,轮叶党参剂量为1000 μg/mL时,iNOS中LPS组与轮叶党参多糖组光斑强度明显高于正常组,且β-actin中各组量接近。由此得出,RAW 264.7在轮叶党参粗多糖的作用下可增加对iNOS mRNA的生成。而轮叶党参粗多糖可能通过提高RAW 264.7 iNOS mRNA表达,调节增加NO的释放量。

图1 轮叶党参多糖作用RAW 264.7 细胞后,iNOS mRNA的表达Fig.1 Effects of polysaccharide from Codonopsis lanceolata on iNOS mRNA production by RAW 264.7

3 讨论

脾脏是人体最大的免疫器官,含有大量淋巴细胞与巨噬细胞,参与特异性免疫与非特异性免疫应答[7]。ConA可以刺激脾脏细胞中脾淋巴细胞,是T细胞促有丝分裂剂,主要参与特异性免疫应答,可以刺激脾脏细胞中脾淋巴细胞。IL-2是机体发挥重要调节作用的细胞因子,主要由淋巴细胞产生,其在免疫调节中尤其是特异性免疫方面起重要作用。IL-2可以参与T淋巴细胞的增殖与分化,增强一些细胞活性,例如:Tc细胞、NK细胞和LAK细胞活性等[8],并且可诱导IFN-γ的产生。而IFN-γ具备免疫调节的活性[9],可增强T淋巴细胞与B淋巴细胞免疫功能[10]。Wang 等[11]实验证明大叶南五味子多糖能够体外刺激鸡脾淋巴细胞分泌IL-2,IFN-γ来调节机体免疫机能。郑乃珍等[12]研究表明猴头菇多糖能够协同ConA对小鼠脾细胞分泌Th1(IL-2、TNF-α、INF-γ)、Th2(IL-6、IL-4)细胞因子及基因表达的影响从而促进机体双重免疫调节。王思芦等[13]报道鸡枞菌多糖可明显促进小鼠脾淋巴细胞分泌IL-4、IL-2、INF-γ细胞因子,增强小鼠T细胞免疫功能的影响。

IL-6能诱导活化B细胞,促使其分泌抗体,参与T细胞的活化、增殖及分化[14]。TNF-α增强巨噬细胞的活性和杀伤功能增强巨噬细胞促免疫应答的能力[15-16]。NO被认为是一种重要的活性介质,免疫系统产生的NO分子在宿主免疫防御、组织修复等生理活动中发挥重要的作用[17]。巨噬细胞生成的NO具有细胞毒作用,既可杀伤侵入机体的有害物质,又能够抑制癌细胞的增殖[18]。杨修仕等[19]研究显示西洋参多糖可促进巨噬细胞分泌NO、TNF-α、IL-6及IL-10细胞因子,因而具备较强免疫活性。郝慧慧等[20]研究表明红毛五加多糖可促进巨噬细胞分泌IL-6、TNF-α、NO,增强巨噬细胞吞噬能力,可活化巨噬细胞,起到免疫正向调节作用。巨噬细胞对非特异性免疫发挥重要作用,可以通过分泌各种细胞因子来调节机体免疫能力[21]。NO的合成主要受一氧化氮合酶(NOS)的调节。NOS有三种亚型,即nNOS,eNOS,iNOS[22]。杨兴斌等[23]研究证明当归多糖通过增强表达iNOS mRNA,合成蛋白质来诱使巨噬细胞分泌NO。

4 结论

本文中轮叶党参粗多糖可以促进脾淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ,浓度极显著高于阳性对照组(p<0.01),即可认为轮叶党参粗多糖为T细胞功能的促进剂,与ConA协同作用于T淋巴细胞,具有增强T细胞免疫活性的功能。轮叶党参粗多糖也可显著促进RAW264.7的增殖(p<0.05),极显著增加RAW264.7分泌IL-6、TNF-α、NO(p<0.01),即可说明轮叶党参粗多糖可活化、增强巨噬细胞活性等作用,从而发挥增强非特异性免疫的作用。同时,本文还检测了iNOS mRNA的表达,结果证明其能够明显增强巨噬细胞iNOS mRNA的表达水平,提示轮叶党参粗多糖通过促进巨噬细胞iNOS mRNA的表达,从而提高NO的生成。综上表明,轮叶党参粗多糖可增加脾淋巴细胞与RAW264.7分泌IL-2、IFN-γ、IL-6、TNF-α、NO,促进RAW 264.7增殖,iNOS mRNA表达,对以T细胞与巨噬细胞发挥主要作用的特异性免疫与非特异性免疫活性有正向调节的作用,为轮叶党参的进一步研究奠定了一定的理论基础。