OPA-FMOC在线柱前衍生高效液相色谱法 测定不同产地燕窝中氨基酸含量

上官国莲,梁雪琪,黄桂东,黎小鹏,曾巧辉,*

(1.佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山 528225;2.中山市农产品质量监督检验所,广东中山 528400;3.中山市三乡镇农产品检验检测站,广东中山 528463)

燕窝(edible bird’s nest),雨燕科动物金丝燕及同属多种金丝燕用唾液和少量羽毛混合黏结所筑成的巢窝,是中国著名的传统补品[1-2]。研究表明,燕窝中含有丰富的活性唾液酸糖蛋白、矿物质、碳水化合物、维生素及氨基酸等多种天然营养物,有补中益气、滋阴润燥等功效[3]。然而,目前市场上燕窝行业并没有统一的产品标准,质量参差不齐,部分不法商人为得到高额利润,通过添加明胶、银耳、蛋清和猪皮胶原等成分来增加燕窝的重量,以次充好,以假乱真[2,4]。为了规范燕窝市场,杜绝劣质燕窝交易,迫切需要建立燕窝关键成分分析体系,以期从科学的角度鉴定燕窝真伪及品质。

氨基酸是燕窝的关键生物活性成分,其含量、种类及比例是评价燕窝营养价值优劣的主要指标之一[5]。Warasri等[6]研究表明,燕窝中蛋白质含量占60%以上,因此,定量监测分析燕窝氨基酸组成及含量对客观分析燕窝质量及真伪有重要意义[7]。目前常用的燕窝氨基酸检测仪器有氨基酸分析仪和高效液相色谱仪(High performance liquid chromatography,HPLC)以及生物探针技术[8]等,氨基酸分析仪采用阳离子交换色谱分离、柱后茚三酮衍生分光光度检测技术等[9],检测过程耗时长达1小时,仪器在运行时茚三酮沉淀易堵塞管路,且重现性不理想。液相色谱仪主要采用柱前衍生法和柱后衍生法[10],其中异硫氰酸苯酯(Phenyl isothiocyanate,PITC)[11-14]和邻苯二甲醛-9-芴甲基氯甲酸酯法(O-phthalaldehyde-9-fluorenylmethyl chloroformate,OPA-FMOC)[15]较为常见,柱前衍生PITC法反应速度慢且易受试剂干扰,而OPA-FMOC法可克服上述缺点,并可同时检测一级和二级氨基酸,应用相对广泛,且未见此法在燕窝氨基酸测定中的应用。

本文以燕窝为研究对象,邻苯二甲醛(O-phthalaldehyde,OPA)和9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)为衍生试剂,通过柱前衍生化法,优化测试条件,建立能同时检测22种氨基酸的快速检测方法,采用HPLC结合荧光检测器对10批次燕窝中22种氨基酸含量进行分析,以期为鉴定燕窝真伪及品质提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

燕窝食材 来自马来西亚(燕盏、官燕碎、白燕碎)、印度尼西亚(官燕碎、白燕碎、燕盏)、泰国(白燕碎、血燕、燕盏、官燕碎),共10个批次,分别标记为样品1、2、3、4、6、7、5、8、9、10。

硼酸盐缓冲液、OPA、FMOC、17种氨基酸混标、天门冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸标准品等 色谱纯,安捷伦科技(中国)有限公司;盐酸、磷酸氢二钠、苯酚等 国产分析纯,sigma-aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;氢氧化锂 优级纯,sigma-aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;甲醇、乙腈 色谱纯,德国默克公司;超纯水 Milli Q净化系统自制。

HPLC(型号1260 infinity II)、可变波长扫描紫外检测器(Variable wavelength scanning UV detector,VWD)荧光检测器(Fluorescence detector,FLD)、自动进样器(型号1329B)等 美国安捷伦公司;Milli Q 净化系统 德国默克公司;氮吹仪 杭州雪中炭恒温技术有限公司;十万分之一分析天平 梅特勒托利多公司。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂的配制 天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro),17种标准品为混合标准品,每种氨基酸的浓度为1 μmol/mL。

天门冬酰胺(Asn):准确称取0.14615 g天门冬酰胺标准物质,用超纯水溶解并定容到10 mL的容量瓶中,最终浓度为100 μmol/mL,摇匀,4 ℃保存。

谷氨酰胺(Gln):准确称取0.13212 g谷氨酰胺标准物质,用超纯水溶解并定容到10 mL的容量瓶中,最终浓度为100 μmol/mL,摇匀,4 ℃保存。

色氨酸(Trp):准确称取0.20433 g色氨酸标准物质,用超纯水溶解并定容到10 mL的容量瓶中,最终浓度为100μmol/mL,摇匀,4 ℃保存。

羟脯氨酸(Hyp):准确称取0.13113 g羟脯氨酸标准物质,用超纯水溶解并定容到10 mL的容量瓶中,最终浓度为100 μmol/mL,摇匀,4 ℃保存。

肌氨酸(Sar):准确称取0.08909 g肌氨酸标准物质,用超纯水溶解并定容到10 mL的容量瓶中,最终浓度为100 μmol/mL,摇匀,4 ℃保存。

校核标准品:GBW(E)100010小麦粉。

1.2.2 仪器分析条件 本研究通过OPA法衍生一级氨基酸,FMOC法衍生二级氨基酸的柱前衍生法,使用了VWD和FLD两种检测器对氨基酸进行检测,并对两种检测器的优劣进行比较。安捷伦自动进样器条件:参考苏建坤[16]、徐飞[17]、裴玉[18]等的研究方法,结合本实验室的实际进行适度改进,形成本研究的OPA-FMOC柱前衍生法,进样程序设置如下:吸取硼酸盐缓冲液2.5 μL(瓶1);吸取样品0.5 μL,在空气中混合,最大速度,2次;等待0.5 min;用未加盖瓶中的水清洗针头(从2号位的瓶子中吸取0 μL H2O);吸取0.5 μL OPA(瓶3),在空气中混合,最大速度,6次;用未加盖瓶中的水清洗针头(从2号位的瓶子中吸取0 μL H2O);吸取FMOC 0.5 μL(瓶4),在空气中混合,最大速度,6次;吸取32 μL H20(瓶5),在空气中混合,最大速度,2次;进样。

检测器的选择:VWD检测条件:0～10.35 min,波长338 nm;10.35 min波长切换至262 nm。FLD检测条件:0～10.35 min,Ex=340 nm,Em=450 nm,增益为10;10.35 min波长切换到Ex=266 nm,Em=305 nm,增益为9。

色谱柱的选择:氨基酸的快速检测参考安芳[19]、王星[20]、陶蓓蓓[21]等的研究方法,并结合实际情况做了适度改进,具体条件如下。色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)和色谱柱Agilent Poroshell HPH-C18(4.6 mm×150 mm,3.5 μm):柱温45 ℃;流速为1.5 mL/min;进样量0.5 μL,系统由A(pH8.2,10 mmol/L Na2HPO4水溶液)和B(乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10,V/V/V)两个通道组成。流动相A的平衡浓度为98%,B为2%;0.35～13.4 min过程中,A的比例降至43%,B的比例升至57%;13.4～13.5 min过程中,A的比例升至57%,B的比例降至43%;13.5～14.0 min过程中,A的比例降为0,B的比例升至100%。

1.2.3 样品处理 燕窝酸水解前处理方法参照芮鸿飞等[11]的方法进行,称取燕窝样品20 mg左右,精确记录至0.1 mg,加入6 mol/L盐酸10 mL到50 mL样品瓶中,加入3～5滴苯酚,用氮吹仪吹扫1 min后,迅速密封瓶口放入110 ℃烘箱水解24 h。冷却,混匀,开盖,把酸解样品过滤到容量瓶中,并用超纯水多次洗涤样品瓶,最终定容到25 mL。

燕窝碱水解前处理方法参照蒲云月等[22]的方法进行,称取燕窝样品40 mg左右记录数据,加入2 mL 4 mol/L氢氧化锂到20 mL样品瓶中,用氮吹仪吹扫1 min后,迅速密封瓶口放入110 ℃烘箱水解24 h。冷却,混匀,开盖,把碱解样品过滤到容量瓶中,并用超纯水多次洗涤样品瓶,最终定容到25 mL。

分别吸取上述酸处理和碱处理的样品各100 μL到样品瓶中,用超纯水定容到1 mL,供上机测定使用。

2 结果与分析

2.1 检测器选择

VWD检测器检测结果见图1。FLD检测器检测结果见图2。由图1和图2可知,采用VWD检测氨基酸时候,色谱图中4～5 min之间隆起一个小包,导致基线不平,对Arg和Ala的定量分析造成一定影响。相对而言,FLD检测图的总体响应值比VWD高,且基线平稳,杂质干扰少。同时,由于Lys与Hyp之间切换波长有0.1 min的间隔,若时间小于0.1 min则会出现基线跳跃式波动(图3),最终对Lys与Hyp的定量分析造成不利影响。因此,在切换波长不小于0.1 min的前提下,本文优先选择FLD进行后续实验。

图1 VWD检测22种氨基酸的色谱图Fig.1 Chromatograms of 22 amino acids with VWD

图2 FLD检测22种氨基酸的色谱图Fig.2 Chromatograms of 22 amino acids with FLD

图3 FLD检测22中氨基酸的色谱图(Lys和Hyp之间切换波长的时间小于0.1 min)Fig.3 Chromatograms of 22 amino acids with FLD

2.2 色谱柱选择

不同型号色谱柱Agilent Poroshell HPH-C18(4.6 mm×150 mm 3.5 μm)和Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)对氨基酸的分离效果的检测结果见图2和图4。由图2可知,脯氨酸是所检测氨基酸中最后出峰的化合物,HPH-C18柱在14 min内完成所有氨基酸的检测并得到完全分离。由图4可知,Asp和Glu、Phe和Ile等氨基酸色谱峰部分重叠,未实现基线分离,且检测时间超过17 min。因此,本研究优先选取HPH-C18柱进行后续的氨基酸检测分析。

图4 Agilent ZORBAX Eclipse AAA柱 检测22中氨基酸的色谱图Fig.4 Chromatograms of 22 amino acids equipped with Agilent ZORBAX Eclipse AAA column

2.3 前处理方法选择

常规水解法(酸水解法)是指在6 mol/L的盐酸作用下,将样品中的蛋白质水解成单一的氨基酸,使氨基酸从蛋白的结合状态中游离出来的方法。在该水解过程中,Trp全部被破坏,无法测量。然而,Trp是蛋白质的重要成分,是人和各种动物生长发育不可缺少的必需氨基酸之一,碱水解法适用于色氨酸的测定[23]。本文发现,在定容过程中,酸水解和碱水解的样品若同时定容于同一容量瓶中会出现浑浊现象,最终选择酸水解以及碱水解分开定容,合并两组定容的样品,待测。

2.4 线性范围及相关系数

在以上优化的实验条件下,各取0.5 μL浓度分别为5、10、20、50、100、200 nmol/mL的标准溶液进样,记录色谱图得出22种氨基酸的线性方程和相关系数,以最低浓度混合标准品逐步稀释,进样并分析确定检出限(LOD),结果见表1。由表1可知,相关系数R2均大于0.998,说明所有的22种氨基酸均呈现良好的线性关系,且检出限较低。

表1 标准曲线回归方程及相关系数Table 1 Linear equation of correlation coefficient

2.5 回收率和方法精密度

本文采用两种加标方法计算回收率,一是使用GBW(E)100010小麦粉进行校核(该标物只标明15种氨基酸的含量);二是采用在已知氨基酸含量的燕窝样品中加入22种氨基酸标准品的方法,每个样品的添加浓度均为10 nmol/mL。分别重复6平行样品。从表2中数据可以看出,两种质控方法的回收率并无显著差异,虽然使用标准样校核相对方便,但含硫氨基酸Cys、Met的回收率明显偏低,相对标准偏差较大。

表2 加标回收率和方法精密度Table 2 The average spiked recoveries and relative standard deviations

2.6 样品中氨基酸的快速测定

通常市场上会在燕窝里掺杂胶原蛋白造假,但胶原蛋白中含有氨基酸Hyp和Sar,而燕窝中却没有,所以通过检测是否存在Hyp和Sar,判定燕窝是否添加胶原蛋白。由表3可知,Hyp、Sar均为未检出,证明10批次的燕窝中均没有掺杂其他含胶原蛋白的物质。此外,所有被检燕窝中均检测出其他20种氨基酸,包括8种人体必需氨基酸,总氨基酸含量为76.7～92.5 g/100 g,必需氨基酸为18.4～23.4 g/100 g,必需氨基酸占总氨基酸的比例为22.7～26%。其中,含硫氨基酸Cys在单个氨基酸中的比例最高,与Warasri等[6]的实验结果相符。因此可得,所测10批次燕窝中的氨基酸含量丰富、种类齐全,品质较佳,为实现燕窝的表皮生长因子样活性、抗流感病毒、抑制凝血活性、改善骨强度和激素含量等生物活性提供物质基础[24]。

10批次的燕窝22种氨基酸含量相对标准偏差在6.7～45.9%之间,表明各批次燕窝的氨基酸组成存在差异。由表3可知,Asn、Met、Trp和Ile等氨基酸的变异系数超过30%,因此,选择这四种氨基酸来分析不同产地和品种的燕窝间氨基酸的差异。从产地分析,在所测燕窝样品中,泰国的血燕、燕盏和马来西亚的官燕碎总氨基酸含量较高,印尼的官燕碎总氨基酸含量较低,泰国和印尼的白燕碎中必需氨基酸含量较高。从品种来看,白燕碎的氨基酸含量略低。燕盏中Asn的高于其他品种的燕窝;马来西亚和印尼的官燕碎中Met的偏低较多,马来西亚的燕盏中Met含量较高;血燕中的Trp含量极低,其他品种燕窝均含有较高的Trp。样本之间的差异可能是由燕子的品种、成熟度和物种之间的差异以及鸟类生活的地理位置和环境造成的[25]。考虑到Tyr和Glu的含量差异被建议用作将住宅燕窝和洞穴燕窝区分开来[26],本文也能为燕窝来源的鉴定和产品的采购提供一定的参考,对氨基酸有特别要求的人群可以选择性挑选燕窝品种和产地。

表3 不同产地10批次燕窝的氨基酸组成分析(n=2)Table 3 Amino acids composition of edible bird’s nest collected from various locations of 10 batches(n=2)

3 结论

本文基于在线衍生化反应机理,把自动在线衍生化(OPA-FMOC)与HPLC相结合,其中一级氨基酸用OPA、二级氨基酸用FMOC进行衍生,实现了快速和高灵敏度分析。两种检测器对22种氨基酸仪器方法进行比较,最终选用响应值高、分离效果好的FLD检测器对氨基酸进行分析,整个方法分析过程快速、准确、灵敏且重现性好,适用于燕窝中氨基酸含量的检测分析。重要的是,氨基酸Hyp和Sar的有无可作为判断燕窝中有无掺杂猪皮等含有胶原蛋白的物质,氨基酸的组成比例和含量可作为燕窝是否掺假以及掺假多少的判断依据之一。此外,燕子的品种、成熟度和物种之间的差异以及鸟类生活的地理位置和环境会造成燕窝中氨基酸的种类和含量的差异,Tyr和Glu的含量差异被建议用作将住宅燕窝和洞穴燕窝区分开来。本文也能为燕窝来源的鉴定和产品的采购提供一定的参考,对氨基酸有特别要求的人群可以选择性挑选燕窝品种和产地。本文所测的十种燕窝中,都没有掺杂含有胶原蛋白的物质,且氨基酸含量丰富,种类齐全,品质较佳。