桦褐孔菌黄酮类化合物的 提取工艺优化及抗氧化活性研究

张 静,孙晶波,盛 瑜,安丽萍,杜培革,郭 笑

(北华大学药学院,吉林吉林 132013)

桦褐孔菌[Inonotusobliquus(Pers.Fr.)Aoshi],又名白桦茸、黑桦菌、桦菌等,属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属[1-3],是生长在俄罗斯、中国吉林长白山以及日本北海道等寒冷地区白桦树上的一种特殊真菌[4]。早在16世纪,桦褐孔菌就被东欧一些国家用来治疗胃癌、心脑血管疾病以及糖尿病等[5]。大量研究发现,桦褐孔菌具有多种药理学作用,包括抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、抑菌、降糖、保肝以及免疫调节等[6-10],其中以其抗肿瘤和抗氧化活性较为突出。

黄酮类化合物(flavonoids compounds)是自然界植物中分布最广的一类天然产物,存在于植物体所有部分,常以游离态存在[11],对植物的生长、发育、开花、结果以及抵御异物侵入起重要作用[12]。黄酮类化合物具有广泛的生物活性,它在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、防治心脑血管疾病以及增强免疫力等方面都具有明显作用[13-15]。此外,研究表明,黄酮类化合物还具有降压、降血脂、保肝、解痉等生物活性[16-17],受到国内外学者的广泛关注。然而目前,国内外对于桦褐孔菌黄酮类化合物的研究多集中在其多糖成分,而对桦褐孔菌黄酮的研究较少。

本文利用乙醇热回流法[18]对桦褐孔菌黄酮类化合物进行提取,并对其抗氧化活性进行测定,相关结果为进一步研究桦褐孔菌黄酮及开发相应的抗氧化食品、药品、保健品等提供理论基础,也为促进我省桦褐孔菌相关产业的发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野生桦褐孔菌 采摘于2015年10月,2016年3月合作单位胡庆余堂提供,经北华大学生药学副教授李凤丽鉴定为野生桦褐孔菌Inonotusobliquus(Pers.Fr.)Aoshi的子实体;无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、醋酸、无水醋酸钠、三氯化铁、硫酸亚铁、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、过硫酸钾 分析纯,天津市永大试剂有限公司;芦丁标准品(纯度≥98%) 成都普菲德生物技术有限公司;2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS,纯度≥98%) 北京索莱宝科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,纯度≥97.0%) 东京化工业株式会社MNEVG-T0;抗坏血酸(VC,纯度≥99.7%) 天津市永大试剂有限公司;2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ,纯度≥98%) 都莱生物技术有限公司R1707。

GZX-9140ME型数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;ATY224型电子天平 日本岛津公司;HH·S 1-Ni型电热恒温水浴锅北京长安科学仪器厂;RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;UV-2550型紫外分光光度计 日本岛津公司;infiniteM200型酶标仪 瑞士Tecan公司;ThermoMixer C型恒温振荡器 德国Eppendorf公司;FiveEasy plus 型pH仪 瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制 参照田春莲等[19]的硝酸铝显色法对梯度浓度芦丁标准品溶液,于510 nm处测吸光度值。以吸光度值(OD)为纵坐标,标准对照品浓度(g/mL)为横坐标,绘制芦丁标准曲线。

1.2.2 黄酮类化合物的提取 取适量桦褐孔菌于恒温鼓风干燥箱105 ℃干燥至恒重。超微粉碎机粉碎,过60目筛。准确称取桦褐孔菌粉末,以一定质量浓度的乙醇为提取剂一定温度回流提取,上清液即为桦褐孔菌黄酮类化合物粗提液,收集上清液,重复2次,合并上清,70 ℃、55 r/min旋转蒸发仪浓缩(V)。利用硝酸铝显色法[17-18]测定桦褐孔菌黄酮类化合物浓缩液中的黄酮含量,计算提取率,芦丁标准品做对照。

式中:x为据芦丁标准曲线所得测试样桦褐孔菌黄酮类化合物浓度(g/mL);m为桦褐孔菌粉末质量(g);V为桦褐孔菌黄酮类化合物浓缩液体积(V)。

1.2.3 单因素实验 采用1.2.2工艺提取桦褐孔菌黄酮类化合物,进行单因素实验,考察各因素变量对桦褐孔菌黄酮类化合物提取率的影响。条件为:固定提取温度80 ℃、提取时间1 h、乙醇浓度70%,重复2次,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)对黄酮提取率的影响;固定反应条件料液比1∶20 g/mL、提取时间1 h、乙醇浓度70%,重复2次,考察不同提取温度(55、65、75、85、95 ℃)对黄酮提取率的影响;固定反应条件料液比1∶20 g/mL、提取温度80 ℃、提取时间1 h,重复2次,考察不同乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%)对黄酮提取率的影响;固定反应条件料液比1∶20 g/mL、提取温度80 ℃、乙醇浓度70%,重复2次,考察不同提取时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)对黄酮提取率的影响。

1.2.4 正交实验据 根据单因素实验结果,选取各因素影响黄酮类化合物提取率效果最明显的因素,采用四水平三因素L9(34)的正交实验设计,以确定桦褐孔菌黄酮类化合物提取的最优条件。

表1 正交因素水平设计Table 1 Orthogonal factor level design

1.2.5 抗氧化活性实验 取一定量最佳工艺条件下制备的桦褐孔菌黄酮类化合物,进行抗氧化活性实验。

1.2.5.1 总抗氧化能力的测定 将300 mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH仪测定醋酸调pH至3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液与20 mmol/L FeCl3溶液以10∶1∶1比例混匀,制成FRAP工作液。吸取20 μL系列浓度为100、200、400、600、800、1000 μmol/L的FeSO4溶液于96孔酶标板中,再分别加入150 μL FRAP工作液,恒温振荡器混匀,37 ℃静置10 min,于593 nm读取吸光度值。以FRAP值(即FeSO4溶液的浓度(mol/L)为纵坐标,吸光度值(OD)为横坐标绘制标准曲线[20-21]。

准确吸取VC和95%乙醇配制的桦褐孔菌黄酮类化合物溶液及其稀释液各20 μL于96孔酶标板,各孔分别加入150 μL FRAP工作液,593 nm读取吸光度值Ai。以用水代替FRAP工作液的反应液做空白(A0),VC做标准对照。由Ai- A0的差值在标准曲线上获得其相应的FeSO4浓度(mol/L),即得桦褐孔菌黄酮类化合物的总抗氧化能力(FRAP)值。

1.2.5.2 DPPH·清除率的测定 用95%乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液备用。用蒸馏水配制不同浓度(0.0050、0.0100、0.0200、0.0400、0.0800、0.1000 mg/mL)VC溶液和95%乙醇配制的不同浓度桦褐孔菌黄酮类化合物溶液适量。分别吸取100 μL VC溶液于96孔酶标板中,再分别加入100 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液,恒温振荡器迅速混匀,室温避光反应10 min,于517 nm读取吸光度值。同时用蒸馏水或95%乙醇做空白。以对DPPH·清除率为纵坐标,溶液浓度(mg/mL)为横坐标绘制清除率曲线[22-23]。用VC做标准对照。

式中,Ai:样品溶液+DPPH溶液的吸光度值;Aj:样品溶液+95%乙醇的吸光度值;A0:水/95%乙醇+DPPH溶液的吸光度值。

1.2.5.3 ABTS·清除率的测定 将100 mL 7 mmol/L ABTS和1.782 mL 140 mmol/L过硫酸钾(使过硫酸钾终浓度为2.45 mmol/L)混匀,室温避光静置过夜,使成ABTS·工作液。开始测量前用pH6.8的PBS缓冲液稀释至A734=0.700±0.020。吸取40 μL系列浓度为0.0000、0.1000、0.2000、0.4000、0.6000、0.8000、1.0000 mg/mL的VC溶液和95%乙醇配制的黄酮类化合物样品溶液于96孔酶标板中,再分别加入160 μL ABTS·工作液,混匀,25 ℃静置4 min,于734 nm读取吸光度值。不加样品的反应液做空白;蒸馏水代替ABTS·工作液做对照。以清除率为纵坐标,浓度(mg/mL)为横坐标绘制清除率曲线[24-25]。用VC做标准对照。

式中,Ai:VC溶液+ABTS·工作液的吸光度值;Aj:样品溶液+蒸馏水的吸光度值;A0:水/95%乙醇+ABTS·工作液的吸光度值。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

由图1得硝酸铝显色法线性回归方程:y=0.01051x+0.00192,R2=0.99991。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比对桦褐孔菌黄酮类化合物提取率的影响 不同料液比提取桦褐孔菌黄酮类化合物的结果如图2所示,料液比为1∶10～1∶20 g/mL时,提取率随提取溶剂用量的增大而增大,料液比为1∶20时提取率最高为6.11%,之后随提取溶剂用量的增大,由于液体量增多,浓缩时间增长,损失量增多,导致桦褐孔菌黄酮类化合物提取率降低。

图2 料液比对桦褐孔菌黄酮类化合物提取率的影响Fig.2 Effect ofsolid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids from Inonotus obliquus

2.2.2 提取温度对桦褐孔菌黄酮类化合物提取率的影响 不同温度提取桦褐孔菌黄酮类化合物的结果如图3所示,温度为55～75 ℃时,提取率随提取温度的升高而增大,温度为75 ℃时提取率最高为9.33%,之后随提取温度的升高,黄酮被破坏和降解,其他可溶性杂质析出,影响黄酮的溶解,致桦褐孔菌黄酮类化合物提取率降低。

图3 提取温度对桦褐孔菌黄酮类化合物提取率的影响Fig.3 Effect of extractiontemperature on the extraction rate of flavonoids from Inonotus obliquus

2.2.3 乙醇浓度对桦褐孔菌黄酮类化合物提取率的影响 不同乙醇浓度提取桦褐孔菌黄酮类化合物的结果如图4所示,乙醇浓度为50%～60%时,提取率随乙醇浓度的升高而增大,乙醇浓度为60%时提取率最高,为7.29%,之后随乙醇浓度的升高,黄酮溶解率降低,导致桦褐孔菌黄酮类化合物提取率降低。

图4 乙醇浓度对桦褐孔菌黄酮类化合物提取率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids from Inonotus obliquus

2.2.4 提取时间对桦褐孔菌黄酮类化合物提取率的影响 不同时间提取桦褐孔菌黄酮类化合物的结果如图5所示,提取时间为0.5～2.0 h时,提取率随时间的增大而增大,提取时间为2.0 h时提取率最高为10.65%,之后随时间的增大,致已经溶解的黄酮被药渣反吸,使桦褐孔菌黄酮类化合物提取率逐渐降低。

图5 提取时间对桦褐孔菌黄酮类化合物提取率的影响Fig.5 Effect of extractiotime on extraction rate of flavonoids from Inonotus obliquus

2.3 正交实验

由表2方差结果可知,各因素对桦褐孔菌黄酮类化合物提取率影响的大小顺序为C>B>D>A,即提取温度>乙醇浓度>提取时间>料液比。由K值可知,优化工艺组合为A3B2C2D2,而正交实验提取率最高组合为A1B2C2D2,故将两组分别进行验证实验。其中A3B2C2D2组合的平均提取率为10.66%±0.17%,A1B2C2D2组合的平均提取率为10.62%±0.33%,证明桦褐孔菌黄酮类化合物提取率最优条件为正交实验优化工艺组合A3B2C2D2,即料液比1∶25 g/mL,乙醇浓度60%,提取温度75 ℃,提取时间2.0 h。

表2 桦褐孔菌黄酮类化合物热回流法正交实验Table 2 Orthogonal experiment of hot reflux method of flavonoids from Inonotus obliquus

2.4 抗氧化活性实验

2.4.1 总抗氧化能力的测定 由图6得线性回归方程:y=850.28176x-2.35817,R2=0.99996。由图7得线性回归方程:y=0.01171x-0.00112,R2=0.99994。经计算,200 μg/mL时,VC的吸光度(OD)为2.34,桦褐孔菌黄酮类化合物的OD值为0.55,两者的FRAP值分别为1988.05、464.53 μmol/L,即桦褐孔菌黄酮类化合物还原能力相当于VC的0.23倍。

图6 FeSO4的总抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of FeSO4

图7 VC的总抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of VC

2.4.2 DPPH·清除率的测定 由图8可知,VC和桦褐孔菌黄酮类化合物对DPPH· 的清除能力均随着样品质量浓度的增大而增大,其EC50分别为28.95和36.44 μg/mL。桦褐孔菌黄酮类化合物对DPPH·清除能力略弱于VC,但二者对DPPH·的清除能力均能达到80%以上。EC50越小,抗氧化能力最强。说明桦褐孔菌黄酮类化合物对DPPH·存在良好的清除能力。

图8 VC和桦褐孔菌黄酮类物质对DPPH·清除率的影响Fig.8 Effects of VC and flavonoids from Inonotus obliquus on DPPH free radicals clearance

2.4.3 ABTS·清除率的测定 由图9可知,VC和桦褐孔菌黄酮类化合物对 ABTS·的清除能力均随着样品质量浓度的增大而增大,其EC50分别为235.68和299.89 μg/mL。桦褐孔菌黄酮类化合物对ABTS·清除能力略弱于VC,但二者对ABTS·的清除能力均能达到90%以上。说明桦褐孔菌黄酮类化合物对ABTS·存在良好的清除能力。

图9 VC和桦褐孔菌黄酮类物质对ABTS·清除率的影响Fig.9 Effects of VC and flavonoids from Inonotus obliquus on ABTS free radicals clearance

3 结论

该研究利用乙醇热回流法对野生桦褐孔菌进行提取。在温度75 ℃,乙醇浓度60%,提取时间2.0 h,料液比1∶25 g/mL条件下提取黄酮类化合物含量最高为53.25 mg/mL,提取率为10.66%±0.17%,对桦褐孔菌黄酮类化合物的抗氧化能力进行测定发现其具有较强的抗氧化能力:其FRAP值相当于VC的0.23倍;对DPPH·清除率达80%以上;对ABTS·清除率达90%以上。

综上所述,桦褐孔菌中黄酮类化合物含量丰富,且有较强的抗氧化活性,有望作为天然抗氧化剂被广泛应用,本研究为桦褐孔菌黄酮的开发及应用奠定了良好的理论基础。