泡菜中对铅有高吸附性的 乳酸菌的分离鉴定及特性研究

代启虎,欧 杰,李 冉,李柏林

(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306;2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306;3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室,上海 201306)

环境中重金属的污染越来越严重,有害重金属一旦进入人体,在体内会形成蓄积物,难以被降解或排出,从而在机体器官富集,造成不可逆的损伤,对人体产生极大伤害。如日本水俣病、痛痛病以及我国的“镉米”、“血铅”等公共污染事件。铅是一种对人体有害的重金属,进入生物体后,Pb2+积累在肾脏和肝脏,引起肾、肝的损伤,破坏基本的细胞过程并且会影响神经系统[1-2]。

生物修复因其原料广泛、成本低、操作简单、环保,低浓度有较好的去除效果,在低浓度污染治理上也有较好的应用空间,而且不会产生次生危害等特点,成为现阶段研究的热点[3-4],目前主要用螯合物治疗重金属中毒,但治疗的同时会有不良影响,对机体造成损伤、解毒不完全等弊端[5-6]。

乳酸菌是公认的安全级微生物,能够耐受胃酸、胆汁和酶的能力。口服制剂可顺利到达肠道,能够改善机体机能,它对肠道调控、保护、修复的作用已经被证实[7]。随着研究的不断深入,有研究发现一些乳酸菌对重金属有着良好的抗性和吸附性能,并且乳酸菌作为人体肠道内的有益菌群,对人体健康也有很好的保健作用[8]。于上富等[9]研究发现在铅离子初始浓度为9.6 mg/L,加菌量4.2 g/L时德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)KLDS1.0207 铅离子去除率高达95.17%。Halttunen[10]研究发现LactobacillusrhamnosusGG对镉、铅去除率分别为20.1%和60.1%,L.rhamnosusLC705对镉、铅去除率分别为30%和45%,BifidobacteriumbreveBbi99/E8对镉、铅去除率分别为40%和50%。

国内外将乳酸菌作为生物吸附剂的研究还是比较少的,大多数的乳酸菌吸附效率较低,并且大多数对重金属有吸附性的乳酸菌用于食品或人体中还有待考量,而本实验从泡菜中分离具有铅抗性和高吸附性的乳酸菌,可以直接用于腌制泡菜、污水中重金属的去除,并为动物体内铅的去除奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

MRS琼脂培养基、MRS液体培养基sigma aldrich公司;泡菜 成都古味觉食品有限公司;乙酸铅(AR)、盐酸、氢氧化钠、氯化钠均为国产分析纯 国药集团化学试剂有限公司;铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色链珠菌(CanidiaAlbicans)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus) 上海鲁微科技有限公司。

ZHJH-C1112C 超净工作台上海智城分析仪器制造有限公司;AUY120 电子分析天平日本岛津公司;LRH-150F 生化培养箱上海一恒科技有限公司;YXQ-LX高压蒸汽灭菌锅上海博讯实业有限公司;PB-10 pH计德国赛多利斯股份公司;VITEK MS质谱仪法国生物梅里埃公司;ZWY-2102C摇床上海智城分析仪器制造有限公司;AA-7000火焰原子分光光度计日本岛津公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 耐铅菌株的分离及稳定性测定 称取20.0 g泡菜于45 mL无菌生理盐水中,37 ℃、150 r/min振荡30 min后倍比稀释到10-4,各取0.1 mL分别涂布于含有400 mg/L Pb2+的MRS固体平板上,37 ℃ 培养36 h时。根据菌落形态,挑取疑似乳酸菌菌落逐步在含有800、1200、1600、2000 mg/L Pb2+的MRS固体培养基上接种,37 ℃培养36 h时,在含2000 mg/L Pb2+条件下得到的菌株为目的菌株,并依次命名为p1、p2、p3…。将分离得到的单菌落菌株,接种到MRS斜面培养基中,在37 ℃的条件下培养24 h后放置4 ℃的冰箱保藏[11]。

将获得的菌株在含Pb2+400 mg/L的MRS琼脂培养基传5～8代,根据菌株在培养基上的生长状况判断其稳定性。

1.2.2 耐性菌株的吸附铅实验 菌株接种于液体MRS培基中,37 ℃,150 r/min摇床培养2 d,离心收集菌体,用灭菌的去离子水洗涤2遍。称取一定重量菌体(干重)加入到30 mL分别含30 mg/L和100 mg/L Pb2+的溶液中,使菌体浓度达到3 g/L,37 ℃,150 r/min摇床吸附48 h后,12000 r/min离心5 min,取上清用火焰原子分光光度计测吸光度并计算Pb2+的浓度[12]。菌株对铅的吸附能力按下式计算:

式中:C0为最初铅离子浓度,C为加菌处理后铅离子浓度。

1.2.3 菌株的初步鉴定 将目的菌株接种于MRS平板上,37 ℃培养36 h,观察菌落形态、进行革兰氏染色,并选取主要的8种生化试剂对目的菌进行常规生化鉴定[13]。

1.2.4 菌株的质谱鉴定 挑取适量菌株于质谱仪样品检测板上,加0.5 μL 70%甲酸覆盖菌株,随后加1 μLα-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)溶液覆盖。放置于室温,干燥后,将检测板放入质谱仪检测。

仪器参数:LTB MNL 100 nitrogen laser激光器;激光频率60 Hz,线性正离子(LP)采集模式;加速电压2.10 kV,激发电压20.00 kV,聚焦电压6.00 kV,检测电压2.63 kV,质量范围2000～20000 Da。每次实验前用ATCC8739进行质谱仪的质量校正。将靶板送入MALDI-TOF-MS/MS 进样仓,用Launchpad 2.9软件进行质谱采集,并用SARAMIS 4.12分析软件进行比对鉴定分析、聚类分析和主成分分析以及离子峰分析。

1.2.5 菌株的分子生物学鉴定 DNA的提取:用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株总DNA作为模板,选择通用引物 27F:5′-AGTTTGA TCMTGGCTCAG-3′;1492R:5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′作为扩增引物,PCR反应体系见表1。

表1 PCR反应体系Table 1 PCR reaction system

PCR反应程序为:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳,用DNA回收试剂盒回收目的条带,送上海生工生物科技公司测序,结果在NCBI中进行比对。

1.2.6 菌株生长特性研究

1.2.6.1 生长曲线的测定 接3%活化后的菌株于MRS液体培养基中,37 ℃,150 r/min摇床培养,不同时间取出,以空白培养基作为对照,测定OD600值,绘制菌株的生长曲线。

1.2.6.2 温度对菌株生长的影响 接3%活化后的菌株于MRS液体培养基中,置于28、30、35、37、40 ℃的恒温摇床中150 r/min培养,以空白培养基作为对照,培养24 h后,在600 nm处测定其OD值,绘制生长曲线。

1.2.6.2 盐对菌株生长的影响 将活化好的菌株分别接种于含0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的NaCl的MRS液体培养基中,以不接菌的做空白对照,37 ℃、150r/min下摇床培养,36 h后,在600 nm处测定其OD值,绘制曲线。

1.2.6.3 番茄汁对菌株生长的影响 将活化好的菌株分别接种于含0、2%、4%、6%、8%、10%(v∶v)的番茄汁的MRS液体培养基中,以不接菌的做空白对照,37 ℃、150 r/min下摇床培养,36 h后,在600 nm处测定其OD值,绘制曲线。

1.2.6.4 酸耐受实验 用HCl和NaOH将MRS液体培养基pH分别调至为1、2、3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10,灭菌后测初始接菌pH,将活化好的菌株分别接种于上述pH的MRS液体培养基中,以不接菌作为空白,37 ℃、150 r/min下摇床培养,36 h后,在600 nm处测定其OD值,绘制曲线。

1.2.6.5 胆盐耐受实验 将活化的菌株分别接种于含2.0、4.0、6.0、8.0 g/L胆盐的MRS液体培养基中,以不加胆盐的为空白对照,37 ℃培养36 h,稀释适当的倍数后,涂布在MRS固体培养基上,培养24 h,观察菌株的生长状况并计数。

1.2.6.6 消化酶耐受实验 将活化的菌株分别接种于含0.4、0.8、1.1 g/L胰蛋白酶的MRS液体培养基中,以MRS培养基为对照,37 ℃培养36 h,稀释适当倍数后,涂布在MRS固体培养基上,培养24 h,观察菌株的生长状况,并计数。

1.2.6.7 抑菌实验 参照文献[14]用铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus、白色链珠菌(CanidiaAlbicans)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus),以无菌水作空白对照,测定菌株的抑菌性。

1.3 数据处理

实验中每组实验重复三次,用SPSS 23软件进行显著性分析,并用origin 85软件做图。

2 结果与分析

2.1 耐铅菌株的分离及稳定性测定

通过菌株的筛选与分离,最终得到4株耐铅菌株p1～p4,耐铅浓度高达2000 mg/L。传代多次,生长状况无显著变化,说明对铅的耐性稳定。

2.2 菌株吸附铅实验

由图1可知,在不同初始浓度(30和100 mg/L)的铅溶液中,不同菌株对铅吸附能力上差别很大,其中p3菌株在不同初始铅浓度条件下,对铅的吸附能力都是最强的,在100 mg/L的铅溶液中,对铅的吸附率达到78.90%±0.40%,具有研究价值。

图1 菌株对铅的吸附能力Fig.1 The adsorption ability of strains to lead 注:标有不同字母表示菌株间具有显著性差异,p<0.05。

2.3 菌株的鉴定

2.3.1 菌株的初步鉴定 p3菌株的菌落形态为乳白色圆形,菌落小,表面光滑。经革兰式染色观察,细胞成对或成链排列的革兰式阳性菌,主要的生化鉴定结果如表2所示。结果表明p3菌株为乳杆菌属。

表2 p3菌株的生化特性Table 2 Biochemical characteristics of p3 strain

2.3.2 菌株的质谱鉴定 p3菌株的质谱图谱如图4所示,用仪器配套软件SARAMIS 4.12 将获得的质量图谱与标准菌株图谱库进行比对鉴定,与短乳杆菌相似度为96%,鉴定结果表明p3为短乳杆菌。

图2 p3菌株的质谱图谱Fig.2 Mass spectrum picture of p3 strain

2.3.3 菌株的分子生物学鉴定 将得到的菌株16S rDNA基因序列在NCBI上进行比对,选取相似度较高的模式菌株作为对比,

用MEGA5.0软件构建系统发育树,进行聚类性分析,得到的系统发育树如图3所示。由系统发育树可知p3菌株与LactobacillusbrevisATCC 14869(T)亲缘关系最接近,相似度在99.7% 以上,因此认定p3菌株为短乳杆菌。

图3 菌株p3的16S rDNA序列系统发育树Fig.3 Phylogenic tree of strain L4 based on 16S rDNA sequence

2.4 p3菌株生长特性研究

2.4.1 生长曲线测定结果 由图4可知,该菌株在0～2 h处于延滞期,2 h后进入对数生长期,14 h进入稳定期,菌体含量基本达到最大。

图4 菌株生长曲线Fig.4 The strain’s growth curve

2.4.2 温度对菌株生长的影响 温度是影响微生物生长繁殖的重要因素之一,当温度改变时,微生物生长繁殖也会受到影响。微生物的最适生长温度可能是由温度对生物体内无数个酶反应的综合作用决定的。由图5可知,随着温度的升高,菌体含量增大,且在35 ℃时,菌体含量达到最大,由此认为菌株的最适温度为35 ℃,在随着温度升高,菌体含量降低。

图5 温度-OD值曲线Fig.5 Temperature-OD valuecurve

2.4.3 番茄汁浓度对菌株生长的影响 由图6可知,随着番茄汁浓度升高,菌体含量先增大后下降,当番茄汁浓度为2%时菌体含量最大。这是由于番茄汁中含有菌株的生长因子,促进了菌株的生长繁殖,由于每个试管液体总体积、初始MRS液体培养基的浓度一定,及随着番茄汁浓度的升高,降低了MRS液体培养基的浓度,从而减少了菌体浓度。

图6 番茄汁含量-OD值曲线Fig.6 Tomato juice concentration-OD value curve

2.4.4 酸耐受实验 由图7可知,菌株在不同的初始pH环境中培养36h后,菌体含量差异很大,该菌株在pH4～8范围时,生长较好。随着pH的升高,菌浓度逐渐增大,在pH为6.5时,达到最大,之后随pH升高而降低,因此可以认为菌株的最适pH为6.5。pH对乳酸菌的生长影响很大,这是因为细胞膜通透性受其影响,从而影响菌株对营养物质的吸收。

图7 pH-OD值曲线Fig.7 pH-OD value curve

2.4.5 盐耐受实验 由图8可知:菌株在含不同的盐浓度MRS液体培养基中培养36 h后,菌体含量差异较大,当含盐量为0% 时,菌体含量最大,且随盐浓度升高,菌体含量下降。盐浓度在0%～5%时,菌株生长较好。这是由于随盐浓度升高,引起渗透压增大,使细胞内水分外流,细胞胞质分离,对细胞结构和生理上造成损伤,导致细胞停止生长,当达到一定浓度时,甚至造成死亡。由于该菌株是从泡菜中分离得到的,所以比大多数从其它样品中分离得到的乳酸菌具有更高的盐耐受性,李洪淼等[15]从泡菜中分离出的4株乳酸菌在盐度为6%时基本不生长。

图8 盐浓度-OD值曲线Fig.8 Salt concentration-OD value curve

2.4.6 胆盐耐受实验 由图9可知,随着胆盐浓度升高,活菌数逐渐减少,在胆盐浓度达8 g/L时仍生长良好,及菌株能在一定浓度的胆盐条件下生长,人体小肠胆盐浓度一般在3 g/L以下,及该菌株可以很好的存在于小肠内。该结果比刘宏宇等[16]测得10株乳酸菌具有更高的耐胆盐性,这10株菌的耐胆盐性仅有5 g/L。

图9 不同胆盐浓度下活菌数变化Fig.9 The change of live bacteria number under different bile salt concentration

2.4.7 消化酶耐受实验 由图10可知与对照组相比,结果表明,该菌株在含1.1 g/L胰蛋白酶的MRS培养基中生长良好,及菌株能在一定浓度的胰蛋白酶条件下生长。并且该菌株耐胰蛋白酶性比夏爽等[17]分离的20株耐胰蛋白酶的菌株具有更高的耐胰蛋白酶性,这20株菌的耐耐胰蛋白酶性仅有1 g/L。

图10 不同胰蛋白浓度下活菌数变化Fig.10 The change of viable count under different trypsin concentration

2.4.8 抑菌实验 由表3可知,菌株对枯草芽孢杆菌、菌株对铜绿假单胞菌、蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌均有一定的抑制性,其中对铜绿假单胞菌的抑制效果最好。

表3 菌株抑菌性Table 3 Antimicrobial activity

3 结论与讨论

利用微生物去除重金属已经成为研究热点,与传统方法相比,微生物去除重金属具有成本低廉、来源广、吸附速度快、吸附量大等特点。已经有从动物肠道、土壤、食品等材料中分离乳酸菌的报道,但是从泡菜中分离筛选乳酸菌清除重金属的研究较少。

本实验从泡菜中筛选出一株对铅具有高耐受性和吸附性的p3菌株,对铅的耐受性达2000 mg/L,对铅的吸附率高达78.90%。通过形态、生理生化特征,质谱鉴定及16S rDNA序列测定,鉴定结果p3菌株为短乳杆菌。该菌株在含盐0～5% 时生长良好,能耐受pH为2的酸、8 g/L胆盐和1.1 g/L的胰蛋白酶,在pH初值为6.5,温度为35 ℃,番茄汁浓度为2%时菌体浓度最大。

短乳杆菌分布广泛,在泡菜中特别常见,在消化系统中小肠含量最多。研究和报道表明,短乳杆菌具有高产酸、解毒、抑菌和提高机体免疫力等多种生理功效[18-21]近年来已逐渐被广泛的应用在食品生产、饲料加工、水产养殖以及畜禽疾病防治等方面[22-26]。而对铅有高耐受性和高吸附性的短乳杆菌尚未见到报道。本实验筛出的短乳杆菌对不仅对铅具有高耐受性和高吸附性,对酸、盐、胆盐以及胰蛋白酶都有一定耐受性,并且对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及蜡状芽孢杆菌都有抑制作用。