3种稀释液对乐至黑山羊精液品质的影响

吴 爽 ，黎 明 ，眭 丹 ，李作明 ，周玉香

（1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏中牧亿林种羊场，宁夏 银川 750021；3.宁夏鲁宁小尾寒羊种羊场，宁夏 银川 750021）

为了延长精液保存时间、增加人工授精用精液的生产量，实践中往往在鲜精液中加入一定量的保护溶液，即通常所说的“稀释液”。稀释液中常加入一些保护剂成分，常用的有糖类、抗冻剂、非电解质、抑菌物质和抗氧化物质等[1]。糖类对于精子的作用是维持其活力，目前稀释液中常用的有蔗糖、葡萄糖和果糖。糖类的选择因畜禽品种而异，普遍认为果糖较好，但其价格昂贵。生产中也有1～2种糖合用的情况。常温下，糖类对精子具有保护作用，但其机理尚不清楚。研究表明，由乳糖、葡萄糖、柠檬酸三钠组成的稀释液对山羊精液的保存效果较为理想[2]。

精子在附睾中处于弱酸环境，射精后副性腺分泌物偏中性，射出后的精液pH值在7.0左右。缓冲剂能够起到调整精液酸碱度的作用，防止pH值过大或过小。常用的缓冲剂有柠檬酸钠、磷酸二氢钠（钾）和三羟甲基甲烷，这些缓冲剂对精子代谢性酸中毒和酶活动反应具有良好的缓冲作用，国内目前稀释液中常用的基础液是磷酸盐缓冲液（PBS），其pH值接近精液并且与精液基本等渗透压[3-4]。

由于乐至黑山羊采精量少，且通常采用鲜精进行人工授精，导致乐至黑山羊养殖数量受限，养殖成本增高。近年来，人们对种羊的精液稀释液进行了大量的研究，并取得了一定的成果。该研究旨在通过评价柠檬酸-Tris、磷酸盐和OviXcell 3种稀释液对乐至黑山羊精液冷冻保存效果的影响，为生产实践中科学选择山羊精液稀释液，提高山羊精液利用效率提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 药品和仪器

柠檬酸，磷酸氢二钠，甘油，Tris碱，果糖，磷酸二氢钠，青霉素，卵黄，显微镜，电子秤，量筒，烧杯，移液枪头，染色缸，蒸馏水，镊子，移液枪，载玻片，盖玻片，计数器，冰箱，秒表。

1.2 稀释液的配制

1号稀释液为柠檬酸-Tris稀释液，配方为果糖 1 g，柠檬酸 1.4 g，Tris碱 2.42 g，甘油 10 mL；2号稀释液为磷酸盐稀释液，配方为果糖3.5 g，磷酸二氢钠0.4 g，磷酸氢二钠0.2124 g，甘油10 mL；3号稀释液为OviXcell稀释液。以上稀释液定容至100 mL容量瓶。1号与2号稀释液均加入少许青霉素。3种稀释液每种各吸取8份，每份1.5 mL。避免振荡、光照，并尽快采集新鲜精液加入其中以进行精子品质检测。

1.3 精液的采集与稀释

选择宁夏中牧亿林股份有限公司8只健康种用乐至黑山羊，采用假阴道法采集新鲜精液，每只羊分别采集3次，每只乐至黑山羊每次采集精液0.5～1.4 mL。采集的精液应用配制好的稀释液进行2倍稀释，微微摇匀，置于常温环境。将采样管用纱布包裹，置于4℃条件下平衡2 h，观察精子活力，在70%以上即可冷冻。于常温下解冻后，观察精液保存效果。

1.4 精液保存效果评价指标的测定

1.4.1 精子活力的测定：将滴有稀释精液的载玻片加热至37℃，在400倍显微镜下观察并记录。精子活力=呈直线运动的精子数/精子总数×100%。

1.4.2 精子畸形率的测定：将解冻后的精液取1滴平滴于载玻片的右端，取另一张边缘光滑平直的盖玻片呈35°角，自精液滴的左面向右接触样品，将上面的盖玻片贴着平置的载玻片表面，自左向右移动，带着精液均匀地涂抹在载玻片上，自然晾干后，用中性福尔马林固定15 min，水洗后晾干，用滴管吸取配制的Giemsa染液约2.5 mL，均匀涂于抹片上，使染液涂满抹片后静止染色70 min左右，清水漂洗后晾干，在显微镜下观察，每个抹片观察200个以上的精子。畸形包括头部畸形、颈部畸形、尾部畸形。精子畸形率=畸形精子数/精子总数×100%。

1.4.3 精子顶体完整率的测定：方法同上。精子顶体不完整情况分为：顶体膨胀型、部分破损型、顶体全脱型。精子顶体完整率=顶体完整的精子数/精子总数×100%。

1.5 数据处理

使用SPSS 20.0软件，采用方差分析法对试验数据进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 3种稀释液对精子活力的影响

由表1可知，在采集后精子的活力差异不显著（P＞0.05）。平衡后3种稀释液中，1号的精子活力最差，3号的精子活力最强，但组间差异不显著（P＞0.05）。解冻后，1号的精子活力最差，3号的精子活力最强，但各组之间差异不显著（P＞0.05）。

表1 3种稀释液对乐至黑山羊精子活力的影响 %

2.2 3种稀释液对精子畸形率的影响

由表2可知，在3种稀释液中，3号的精子畸形率最低，2号的精子畸形率最高，但组间差异不显著（P＞0.05）。

表2 3种稀释液对乐至黑山羊冷冻精子畸形率的影响 %

2.3 3种稀释液对精子顶体完整率的影响

由表3可知，在3种稀释液中，1号稀释液的精子顶体完整率最低，3号稀释液的精子顶体完整率最高，但组间差异不显著（P＞0.05）。

表3 3种稀释液对乐至黑山羊冷冻精子顶体完整率的影响 %

3 讨论

3.1 3种稀释液对精子活力的影响

研究表明，冷冻复苏后的精子，超微结构未发生改变的只占冷冻精子总数的8.8%，发生超微结构改变的精子呈现出精子外膜变薄，波浪状改变或破损，胞质、顶体内和线粒体内透光度增加，顶体增宽，甚至顶体外膜破裂，线粒体外形变圆，轴丝增粗等[5]。顶体膜的损伤或破裂，必然导致精子顶体酶活性降低；精子外膜损伤或破裂，精子膜功能受损，则精子存活率呈显著下降趋势，这与该试验结果一致。已有研究表明，精子冷冻可使线粒体结构和功能遭受破坏，ATP生成障碍，进而影响精子的活力[6]。

在该试验中，笔者将3种稀释液应用于乐至黑山羊精液的低温保存，研究采用的是平衡后颗粒冻精快速降温的方法。结果表明，在相同情况下进行解冻后，添加OviXcell稀释液的精液与添加另外2种稀释液的精液相比，其精子活力最强。

3.2 3种稀释液对精子畸形率的影响

随着精子保存温度的降低，精子畸形率显著增加。经过冷冻处理后的鸡精子，畸形率超过了20%，说明低温环境和冷冻操作对精子形态造成了显著的有害影响，在升温或解冻后形成不可逆的畸形率增加，造成精子活率降低，导致母鸡受精率随之下降。另外，低温保存后精子尾部畸形增多，说明低温环境对鸡精子细长的尾部有显著的负面影响，这是由于低温环境使精子休眠后尾部形态发生不规则卷曲，其原因尚有待于进一步观察[7-8]。

该研究结果表明，在相同情况下进行解冻后，添加OviXcell稀释液的精液与添加另外2种稀释液的精液相比，其精子畸形率最低，而添加3种稀释液冷冻保存的精液解冻后其精子畸形率之间差异均不显著（P＞0.05）。

3.3 3种稀释液对精子顶体完整率的影响

精子的顶体是完成受精过程的重要细胞器，顶体完整率越高，存活指数越大，精子的存活时间越长[9]。 由于羊原精中钠的含量较高[9]，精液中的钠可以与稀释液中的柠檬酸结合，维持精液的渗透压，有利于提高精子活力，使顶体完整率增加。

该研究结果表明，在相同情况下进行解冻后，添加OviXcell稀释液的精液与添加另外2种稀释液的精液相比，其精子顶体完整率最高，而添加3种稀释液冷冻保存的精液解冻后其精子顶体完整率之间差异均不显著（P＞0.05）。

4 结论

OviXcell稀释液更适用于乐至黑山羊精液的体外冷冻保存。

[1]杨灿锋，杨利国，蒋杰.几种常用营养试剂对波尔山羊精子活率的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2002（6）：18-19.

[2]李助南，郭良辉，袁微，等.不同稀释液对山羊精液的保存效果[J].湖北农学院学报，2001，21（3）：20-22.

[3]权凯，黄炎坤.鸡精液稀释液研究进展[J].养禽与禽病防治，2006，26（2）：4-5.

[4]MAHADEVAN M M，TROUNSON A O.Relationship of fine structure of sperm head to fertility of frozen human semen[J].Fertility and Sterility，1984，41（2）：287-293.

[5]于德新，尤国才，徐正铨，等.冷冻保存的人类精子超微结构变化[J].男科学杂志，1995，9（3）：148-151.

[6]王欣荣，李彦强.保存条件对鸡精子形态及畸形率的影响[J].黑龙江动物繁殖，2009，17（6）：5-6.

[7]刘建忠.影响鸡精液体外低温保存效果因素的分析[J].畜牧兽医杂志，1997（2）：51-52.

[8]李青旺，武浩.动物繁殖学[M].西安：西安地图出版社，2000：9.

[9]北京农业大学.家畜繁殖学[M].北京：中国农业出版社，1982：9.