巢脾多糖片处方工艺优化及质量分析

时菲菲，陈 倩，殷 玲

（江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300）

巢脾是由蜜蜂筑造的双面布满巢房的脾状蜡质结构，是蜜蜂用于栖息、繁衍后代、贮存食物的场所[1-3]，经过数代蜜蜂的繁衍生息，堆积了大量的茧衣并残留较多蜂产品，使得巢脾成分变得较为复杂。蜜蜂巢脾是一种民间传统动物药，可用于治疗鼻炎、风湿性关节炎、皮肤病等多种疾病。巢脾多糖是蜜蜂巢脾中分离提取得到的多糖组分，与其他来源的多糖一样，在机体中可参与多种生命活动，具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等多种药理作用[4-6]。由于多糖是一类天然产物，具有多种生物活性，同时无毒副作用，使得多糖越来越多地应用于药物和保健食品等方面，因此，对多糖的开发研究变成当今的一大研究热点。目前，对于巢脾多糖的研究报道较少，对于巢脾多糖制剂的研究报道尚处于空白阶段。该研究是在笔者所在课题组开展的巢脾多糖提取工艺研究及脱蛋白工艺研究基础上[7]，通过多指标设计综合评分法筛选优化巢脾多糖片剂处方及工艺条件，以期开发和利用巢脾这一丰富动物药资源，一方面为提高巢脾多糖疗效提供理论基础，另一方面为进一步开发利用巢脾多糖提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 药品与仪器设备

无水磷酸氢钙（上海恒信化学试剂有限公司，药用级）；交联聚维酮（安徽山河药用辅料股份有限公司，药用级）；PVPK30（安徽山河药用辅料股份有限公司，药用级）；硬脂酸镁（江西益普生药业有限公司，药用级）；巢脾多糖（自提）。所用化学试剂均为国产分析纯。

JB/T 5374-1991电子天平 [梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司]；标准检验筛（浙江上虞市道墟张兴纱筛厂）；TDP-1.5单冲压片机 （泰州市金泰制药机械有限公司）；CS-3脆碎度测试仪（天津创兴电子设备有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 制备工艺：巢脾多糖片的制备工艺采用湿法制粒压片法。取干燥后的主药与辅料研细后分别过80目筛，按处方量称取各成分后混匀，加入90%乙醇制软材，过16目筛制粒，制得的颗粒置于60℃真空干燥箱中干燥，控制干颗粒水分含量低于2%，干颗粒过30目筛整粒，加入润滑剂，混合均匀，压片，即得。

1.2.2 辅料筛选：片剂制备需要用到填充剂、崩解剂、黏合剂及润滑剂等辅料，而辅料种类繁多，辅料筛选首先应考虑的因素是所用辅料不影响主药含量的定量分析。该研究采用硫酸—苯酚法测定巢脾多糖的含量[8]。选取常用辅料，采取硫酸—苯酚法进行处理，并于490 nm波长处进行紫外吸收检查。

1.2.3 正交试验优化处方及工艺：为进一步筛选确定各种辅料的使用比例，采用正交试验优化无水磷酸氢钙、交联聚维酮、PVPK30、压片压力等最佳用量及最佳制备工艺条件。选用L9（34）正交试验水平表进行优化试验的设计，以无水磷酸氢钙用量（A）、交联聚维酮用量（B）、PVPK30 用量（C）、压片压力（D）为考查因素，每个因素设计3个水平，因素水平表见表1。以崩解时限、硬度及脆碎度为考查指标，对多糖片的制备质量进行综合评定。巢脾多糖片质量评分标准见表2。

表1 L9（34）正交试验因素水平表

表2 巢脾多糖片质量评分标准

1.2.4 最佳工艺验证：以正交试验优选出的最佳处方工艺条件，按“1.2.1”项下方法平行制备3批巢脾多糖片，分别按照《中国药典》（2015年版）收录的方法对崩解时限、硬度、脆碎度及片重差异进行检查。

1.2.5 样品含量测定

1.2.5.1 标准曲线的制备：分别精密吸取1.02 mg/mL 的葡萄糖溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于25 mL容量瓶中，加水补至1.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，浓硫酸 5 mL，摇匀，静置 10 min，以相应的试剂为空白对照，在490 nm波长处检测。

1.2.5.2 精密度试验：精密称取样品粉末0.500 g置于100 mL容量瓶中，加纯化水溶解并定容，摇匀，精密量取1 mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.5.1”项下方法测定吸光度，连续测定6次。

1.2.5.3 稳定性试验：精密称取样品粉末0.500 g置于100 mL容量瓶中，加纯化水溶解并定容，摇匀，精密量取1 mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.5.1”项下方法分别于 0、0.5、1、2、4、6、12 h 测定吸光度。

1.2.5.4 重复性试验：平行称取样品粉末6份，每份0.005 g，按“1.2.5.2”项下方法处理，微孔滤膜过滤，于490 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算多糖含量。

1.2.5.5 加样回收率试验：精密称取样品粉末0.500 g置于100 mL容量瓶中，加纯化水定容，摇匀，平行6次精密量取该溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，分别加入1.02 mg/mL的葡萄糖溶液0.2、0.2、0.3、0.3、0.4、0.4 mL，按“1.2.5.1”项下方法测定吸光度。

1.2.5.6 样品含量测定：取3批巢脾多糖片样品每批各20片，研细成粉末，精密称取样品粉末每批0.500 g，置100 mL容量瓶中，每批样品平行3份，加纯化水溶解定容，摇匀，精密量取1 mL，置25 mL容量瓶中定容，按“1.2.5.1”项下方法测定吸光度。

1.2.6 体外溶出度试验：取制备好的3批巢脾多糖片样品，按《中国药典》（2015年版）规定的体外溶出度检查方法的桨法进行检查，水浴温度控制在 （37±0.5）℃， 溶出介质为：0.1 mol/L HCl溶液900 mL，转速 100 r/min。 分别于 5、10、15、20、30、45 min取样5 mL，并补充5 mL同温度新鲜0.1 mol/L HCl溶液。样品经微孔滤膜过滤，按“1.2.5.6”项下方法检查含量，计算累积溶出度，绘制体外溶出度曲线。

表3 正交试验结果

表4 方差分析结果

2 结果与分析

2.1 辅料筛选

经紫外吸收检查，无水磷酸氢钙、交联聚维酮、PVPK30、硬脂酸镁无紫外吸收，对巢脾多糖含量测定无影响，可用于巢脾多糖片剂的制备，以上4种辅料分别作为填充剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂，另外经过预试验选择90%乙醇作为润湿剂。

2.2 正交试验

正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。由表3和表4可知，4个因素的影响大小顺序依次为B＞D＞A＞C，即崩解剂用量＞压片压力＞填充剂用量＞黏合剂用量。最佳处方工艺条件为A3B3C1D2，即巢脾多糖22%，无水磷酸氢钙52%，交联聚维酮10%，15%PVPK30-90%乙醇15%，硬脂酸镁1%，压片压力4.2 N。鉴于对巢脾多糖片的质量影响程度不同，综合评定中，崩解时限占总评的50%，硬度占30%，脆碎度占20%。

2.3 含量测定

2.3.1 标准曲线的制备：标准曲线溶液在490 nm波长处检测，以葡萄糖溶液浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.00043x+0.0164，相关系数 r为 0.99921，线性关系在204～1020 μg/mL良好，符合分析要求。

2.3.2 精密度试验：精密度试验溶液在490 nm波长处测定吸光度，连续测定6次，以回归曲线计算出RSD值为0.496%，说明精密度良好。

2.3.3 稳定性试验：稳定性试验溶液分别于0、0.5、1、2、4、6、12 h 在 490 nm 波长处测定吸光度，以回归曲线计算出RSD值为1.40%，说明样品在12 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验：重复性试验溶液在490 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线计算多糖含量，以回归曲线计算出RSD为0.76%，说明该测定方法重现性良好。

2.3.5 加样回收率试验：加样回收率试验溶液分别在490 nm波长处测定吸光度，计算得到平均回收率为99.85%，RSD为1.60%，表明该方法有较好的加样回收率。

2.4 最佳工艺验证

对3批巢脾多糖片样品进行质量检查，结果见表5。由表5可知，崩解时限、硬度、脆碎度及片重差异均合格，说明优化结果较好，工艺稳定。

表5 最佳工艺验证试验结果

表6 样品累积溶出度测定结果

2.5 巢脾多糖片含量检查

按照巢脾多糖片含量检查方法对3批样品进行含量检查，结果显示，3批样品平均含量分别为97.9%、98.2%、97.1%。

2.6 累积溶出度

取制备的3批巢脾多糖片样品分别按上述方法进行累积溶出度测定并记录490 nm波长处的吸光度，计算累积溶出度，结果见表6；绘制溶出曲线，3批样品溶出曲线见图1。结果表明，3批样品10 min累积溶出度均可达到90%以上。

图1 累积溶出度曲线

3 讨论

试验前期首先对辅料进行了筛选，为避免辅料对巢脾多糖含量测定的影响[9]，对多种辅料采用硫酸—苯酚法处理，选取了对含量测定无影响的几种辅料。该试验中通过正交设计及综合评分法得出最佳处方组成及工艺条件，由以上处方工艺条件制备了3批巢脾多糖片样品，并对样品进行质量考查，结果均合格，说明建立的多指标综合评分法是可行的。

由于主药巢脾多糖黏性较大，导致崩解溶出较困难，因此，崩解剂的种类、用量、制粒工艺成为关键。近几年国家对药品质量要求不断提升，累积溶出度对于口服固体制剂愈加成为一个重要的考查指标[10]，一方面对制剂处方设计及制备工艺有良好的指导作用，另一方面可以模拟口服固体制剂体内的释药过程。该试验选取对含量测定无影响的交联聚维酮作为崩解剂，采用湿法制粒工艺制备，对制备的3批样品进行累积溶出度考查，结果表明，3批样品10 min内累积溶出度均达到90%以上，说明处方组成及工艺条件均合理。

我国是养蜂大国，每年淘汰的巢脾数量巨大，巢脾多糖片的开发可以很好地利用这一动物药材资源，有益于产品的推广应用，提高产品附加值，带来经济价值及社会效益，同时对促进巢脾的研究利用具有积极意义。

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