泛发性脓疱性银屑病患者外周血单个核细胞中程序性细胞死亡受体1及其下游因子相关表达研究

朱腾 晋红中

100730北京，中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院皮肤科

泛发性脓疱性银屑病（generalized pustular psoriasis，GPP）是一种系统性炎症性皮肤病，临床上通常以突发红斑以及红斑基础上粟粒大小的无菌性脓疱为主要特点［1⁃2］。有研究表明，程序性细胞死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1）基因缺陷可促进γδT细胞及Th17细胞产生IL⁃17及IL⁃22，从而增加对中性粒细胞的招募，导致银屑病样皮炎的发生［3］。提示PDCD1及其相关受体通路可能与GPP的发生有关。本研究检测PDCD1受体及下游NF⁃κB在GPP患者外周血单个核细胞（PBMC）中的表达量，并检测GPP患者血清中下游白细胞介素17（IL⁃17）、IL⁃22及IL⁃4的含量。

一、对象

2015年5月至2016年11月就诊于北京协和医院皮肤科的GPP患者。入选标准：18～75周岁，性别不限，经临床及组织病理确诊为GPP，入组时处于脓疱发作期。排除标准：抽血前2个月内曾系统使用糖皮质激素、维A酸类、生物制剂及免疫抑制剂等药物；伴有其他类型皮肤病、肿瘤、其他自身免疫病或其他严重疾患。入选GPP患者23例，女11例，男12例，平均年龄35.3岁。健康对照组24例选自北京协和医院体检中心，女12例，男12例，平均年龄38.1岁。两组间性别、年龄差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究通过北京协和医院医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

二、方法

1.标本：采集23例GPP患者及24例健康对照者外周血，分离血清及使用密度梯度离心法提取PBMC。

2.RT⁃PCR检测PBMC中PDCD1及其配体（PD⁃L1和PD⁃L2）和NF⁃κB mRNA的表达：Trizol法提取PBMC中总RNA，实验过程中仅从9例GPP患者及10例健康对照者成功提取RNA，患者组（9例）和对照组（10例）间性别、年龄差异均无统计学意义（P＞0.05）。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列见表1。将提取的RNA逆转录合成cDNA进行扩增。PCR反应体系10 μl，反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃延伸30 s，共40个循环。每升高1℃采集5次荧光信号。以β肌动蛋白为内参基因，使用2⁃△△Ct法计算mRNA的相对表达量。

3.血清中 IL⁃17、IL⁃22及IL⁃4含量检测：使用美国quanticyto公司的酶联免疫吸附试验试剂盒检测23例GPP患者以及24例健康对照者血清中的IL⁃4、IL⁃17、IL⁃22。

4.统计学方法：采用SPSS 16.0统计软件处理数据，计量资料以±s表示。两组间均数比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

三、结果

1.PBMC中PDCD1、PD⁃L1、PD⁃L2及NF⁃κB mRNA表达水平：GPP患者组PDCD1 mRNA的相对表达量低于对照组，PD⁃L1、PD⁃L2 mRNA均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。两组NF⁃κB mRNA相对表达量差异无统计学意义。见表2。

2.血清中IL⁃4、IL⁃17及IL⁃22表达水平：患者组IL⁃4、IL⁃17、IL⁃22表达量均高于对照组，且差异均有统计学意义（P＜0.001）。见表3。

表1 程序性细胞死亡受体1（PDCD1）及配体（PD⁃L1、PD⁃L2）、NF⁃κB基因引物序列

表2 泛发性脓疱性银屑病患者外周血单个核细胞中程序性细胞死亡受体1（PDCD1）及配体（PD⁃L1和PD⁃L2）以及NF⁃κB mRNA相对表达量（±s）

表2 泛发性脓疱性银屑病患者外周血单个核细胞中程序性细胞死亡受体1（PDCD1）及配体（PD⁃L1和PD⁃L2）以及NF⁃κB mRNA相对表达量（±s）

组别患者组对照组t值P值例数9 10 PDCD1 3.13±4.62 23.70±15.33 3.40＜0.05 PD⁃L1（× 10⁃4）5.70±3.07 2.00±1.98 2.96＜0.05 PD⁃L2（× 10⁃4）0.95±0.71 0.16±0.20 3.38＜0.05 NF⁃κB（× 10⁃3）1.90±0.82 1.50±0.91 0.75＞0.05

表3 泛发性脓疱性银屑病患者外周血单个核细胞中白细胞介素4（IL⁃4）、IL⁃17及IL⁃22表达水平（± s）

表3 泛发性脓疱性银屑病患者外周血单个核细胞中白细胞介素4（IL⁃4）、IL⁃17及IL⁃22表达水平（± s）

组别患者组对照组t值P值例数23 24 IL⁃4 99.46±74.74 17.34±47.87 4.46＜0.001 IL⁃17 304.19±280.66 62.38±84.03 3.96＜0.001 IL⁃22 338.37±245.44 28.10±84.88 5.74＜0.001

四、讨论

PDCD1是通过减数杂交技术从小鼠T淋巴细胞杂交瘤细胞克隆而成，其胞质区域N端含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序，C端为一个免疫受体酪氨酸活化基序，与胞内细胞传导有关［4］。有研究表明，PDCD1分子的基因多态性与系统性红斑狼疮［5］、多发性硬化［6］发病相关，但尚无PDCD1 与GPP的研究。

PDCD1及其配体结合后的抑制途径在T细胞反应的各个阶段都发挥了重要的调节作用［7］，若阻断PDCD1及其配体途径，T细胞将缺失有效的负性调节信号，从而导致免疫性疾病的发生。PD⁃L1与PD⁃L2均可表达于T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞及树突细胞表面，并且随着这些细胞的活化而上调［8］。本研究结果显示，GPP患者与健康对照者比较，PBMC中PDCD1 mRNA表达降低，PD⁃L1、PD⁃L2 mRNA表达升高。可能是由于GPP患者PBMC中PDCD1基因的表达量明显下调，PDCD1的负性调控信号减弱，下游信号通路的NF⁃κB等分子过度激活，从而导致T淋巴细胞、B淋巴细胞及单核细胞等过度活化，产生大量的炎症因子。也有研究表明，PD⁃L1及PD⁃L2高表达的淋巴细胞可以诱导PDCD1的表达［9］，因此，PD⁃L1及PD⁃L2的上调也可能是机体对PDCD1的表达量下调的负反馈调节。

有研究证实，PDCD1基因缺陷能够诱发小鼠银屑病样皮炎［3］。本研究发现，GPP患者外周血血清中IL⁃4、IL⁃17及IL⁃22浓度显著增加。这可能与PDCD1基因缺失后失去抑制γδT细胞及Th17细胞产生IL⁃17及IL⁃22的能力，使得IL⁃17及IL⁃22的水平明显增高，从而极大地增加了对中性粒细胞的招募而导致银屑病样皮炎的发生，同时IL⁃4水平增高可进一步上调PD⁃L2表达。而在GPP患者的皮损组织病理中常见表皮海绵状脓疱，位于棘细胞上层（Kogoj海绵状脓疱）和角质层中（Munro微脓疡）。这提示PDCD1的缺失可能导致炎症通路的过度激活，从而导致或加剧GPP的发生发展。

本研究结果显示，PDCD1及其配体在GPP患者PBMC中表达异常，但是否可以通过制备PDCD1功能性蛋白、增强PDCD1的负性信号对GPP进行靶向治疗有待进一步研究。

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