菌落PCR在快速鉴定头癣病原菌中的临床应用

赖美玲 葛小丽 张海平 周成龙 张晓利 杨莉佳

214000江苏，无锡市第二人民医院皮肤科（赖美玲、张海平、周成龙、张晓利、杨莉佳），儿科（葛小丽）

头癣是临床常见的儿童皮肤病，如果不及时诊断治疗或误诊误治，可严重影响患儿及家属身心健康［1］。真菌镜检及培养在头癣的诊断和疗效评价中扮演重要角色。但形态学鉴定菌种耗时长，而常规的分子诊断所需试剂、仪器较多，不利于临床推广［2］。本研究采用形态学鉴定及常规PCR诊断技术，对照评价菌落PCR用于头癣诊断的临床应用价值。

资料与方法

一、临床资料

病例来自2016年1月至2017年3月在无锡市第二人民医院就诊、临床疑诊为头癣并进行真菌鉴定的首诊患者，共17例。

二、真菌镜检

夹取患者病发或皮屑，用复方氢氧化钾（KOH）玻片法进行真菌直接镜检。

三、真菌培养及形态学菌种鉴定

将断发或皮屑接种于含氯霉素和放线菌酮的沙氏琼脂培养基（SDA）上，28℃培养14 d，每日观察生长情况。根据菌落生长速度、大小、形态及颜色等特征和镜下形态进行菌种鉴定，必要时辅以马铃薯葡萄糖琼脂培养基小培养试验。接种3周无生长者视为培养阴性。

四、菌落PCR基因组模板制备

将临床标本接种于SDA培养基上，每天观察，看到有菌落生长时用取菌针挑取少量菌丝体，加入准备好的PCR管（20 μl TE缓冲液）中，100℃水浴5 min，然后立即置于-20℃冰箱中5 min，水浴冻融再重复1次。14 000 r/min（半径8 cm）离心5 min，取1 μl上清液作为模板行PCR。

五、常规PCR基因组模板制备

将临床标本接种于SDA培养基，28℃培养14 d成为丝状菌落，用取菌针尽量刮取多量菌丝体，严格按照Biospin试剂盒说明书制备基因组模板的［3］。

六、PCR扩增

用真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）通用引物ITS 1（5′⁃TCCGTAGGTGAACC TGCGG ⁃3′）和ITS 4（5′⁃TCCTCCGCTTATTGATAT ⁃3′），PCR反应体系25 μl，含10 × 扩增缓冲液2.5 μl，MgCl2（10 mmol/L）1.5 μl，dNTP混合物（10 μmol/L）2 μl，引物（10 μmol/L）各0.5 μl，DNA模板2 μl，Taq DNA聚合酶2 U。反应条件为95℃预变性5 min后，95℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸10 min。扩增产物采用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，每个加样孔点样4 μl，电泳缓冲液为1×TAE，恒压80 V，电泳约30 min。电泳结束后，取琼脂糖凝胶在凝胶成像仪上观察结果并摄片。反应设阴性对照和阳性对照，阴性对照用去离子水代替DNA模板，阳性对照用须癣毛癣菌DNA基因组作为模板。

七、ITS区基因序列分析

PCR产物送生工生物工程（上海）有限公司测定碱基序列，测定结果用Blast比对（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

结 果

一、一般资料

17例儿童头癣患者中，女12例，男5例，年龄3～8岁［（5.24±4.42）岁］。脓癣6例，黑点癣3例，白癣8例。

二、真菌镜检及培养结果

17例中15例真菌镜检阳性，为发内或发外菌丝或孢子，17例真菌培养均为阳性，形态学鉴定结果为须癣毛癣菌5例，紫色毛癣菌1例，红色毛癣菌1例，断发毛癣菌1例，石膏样小孢子菌2例，犬小孢子菌7例。

三、菌落PCR的DNA模板制备时间

17例标本培养至出现肉眼可见菌落且可用于制备DNA模板的时间为（3.82±0.50）d，其中6例3 d，8例为4 d，3例为5 d。

四、菌落PCR与常规PCR、形态学鉴定结果比较

17株菌种菌落PCR均扩增出阳性条带。在相同条件下，菌落PCR与常规PCR扩增产物电泳图结果一致，但前者条带稍暗。见图1。

将菌落PCR产物及常规PCR产物均进行碱基序列测定，测序片段为ITS1和ITS4之间的ITS区，经Blast比对，菌落PCR与常规PCR的菌种鉴定结果一致，其中须癣毛癣菌6例，断发毛癣菌2例，犬小孢子菌7例，石膏样小孢子菌2例。

图1 菌落PCR与常规PCR扩增产物电泳图 M：100 bp Ladder；1：阴性对照；2：阳性对照（须癣毛癣菌）；3～19：常规PCR结果；3a～19a：菌落PCR结果

以常规PCR为标准，菌落PCR菌种鉴定正确率为100%，形态学鉴定正确率为88.2%，其中1株断发毛癣菌被形态学鉴定为紫色毛癣菌，1株须癣毛癣菌形态学鉴定为红色毛癣菌。

讨 论

常规PCR扩增前的DNA制备需要经过破壁、抽提、沉淀、纯化等步骤，所需时间较长，涉及的试剂及仪器较多，这给分子鉴定的临床推广带来较大阻力［7］。如果直接从临床标本提取真菌DNA，则需将标本进行预处理，过程中可能会混入PCR反应抑制物或造成真菌模板DNA的流失，使本来就含量甚微的DNA更难以检测，出现假阴性结果［8］。所以目前极少直接从临床标本提取DNA进行菌种鉴定［9］。

在前期实验中，我们将菌落PCR技术进行优化、改良，应用于丝状真菌的鉴定，阳性率为84.2%［10］。因为菌落PCR省去抽提模板DNA的步骤，直接以菌体煮沸、冻解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，所用实验时间较短，涉及的试剂、仪器较少。但之前的实验研究所用菌种为中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心的标准菌株，未进行临床标本检测。

本研究中，我们收集疑似头癣患者的临床标本进行检测，并在操作过程中不断改进实验细节，优化实验流程，对标本取材的选择、菌落PCR制备模板的条件、PCR的反应条件等进行反复实验，摸索最佳实验条件。17例临床标本的菌落PCR结果均为阳性，并成功测序，可以进行菌种基因型鉴定。为了验证菌落PCR方法的可靠性，我们亦同时进行常规PCR菌种鉴定，经Blast对比后发现，两种技术菌种鉴定结果完全一致。但菌落PCR电泳条带较常规PCR电泳条带暗，可能是由于菌落PCR的DNA模板没有完全清除细胞壁碎片及蛋白质等杂质，这些杂质的存在影响了PCR扩增的反应效率。形态学鉴定因技术人员的主观差异等原因，鉴定正确率不及基因测序的正确率。

本研究结果显示，菌落PCR可用于临床头癣病原菌的检测，鉴定菌种的准确性和可靠性较高，是一种快速简便的分子检测技术，易在临床推广。以后我们将扩大样本量并收集不同的真菌感染病例，以进一步评价该方法的可靠性，为其在临床推广应用奠定坚实的基础。

［1］Hay RJ.Tinea capitis:current status［J］.Mycopathologia,2017,182（1⁃2）:87⁃93.doi:10.1007/s11046⁃016⁃0058⁃8.

［2］Fredricks DN,Smith C,Meier A.Comparison of six DNA extraction methods for recovery of fungal DNA as assessed by quantitative PCR［J］.J Clin Microbiol,2005,43（10）:5122⁃5128.doi:10.1128/JCM.43.10.5122⁃5128.2005.

［3］张晓利,吕雪莲,沈永年,等.4种黑曲霉基因组DNA提取方法的比较［J］.中国真菌学杂志,2011,6（3）:145⁃148.doi:10.3969/j.issn.1673⁃3827.2011.03.005.

［4］Griffin DW,Kellogg CA,Peak KK,et al.A rapid and efficient assay for extracting DNA from fungi［J］.Lett Appl Microbiol,2002,34（3）:210⁃214.

［5］Metwally L,Fairley DJ,Coyle PV,et al.Improving molecular detection of Candida DNA in whole blood:comparison of seven fungal DNA extraction protocols using real⁃time PCR［J］.J Med Microbiol,2008,57（Pt 3）:296⁃303.doi:10.1099/jmm.0.47617⁃0.

［6］康道现,冉玉平,代亚玲.直接从病发提取DNA鉴定菌种诊治万博节皮菌所致脓癣［J］.临床皮肤科杂志,2013,42（6）:348⁃350.doi:10.3969/j.issn.1000⁃4963.2013.06.008.

［7］张晓利,吕雪莲,沈永年,等.菌落PCR技术快速鉴别丝状真菌的实验研究［J］.中华皮肤科杂志,2011,44（8）:556⁃559.doi:10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2011.08.009.

［8］Metwally L,Fairley DJ,Coyle PV,et al.Improving molecular detection of Candida DNA in whole blood:comparison of seven fungal DNA extraction protocols using real⁃time PCR［J］.J Med Microbiol,2008,57（3）:296⁃303.doi:10.1099/jmm.0.47617⁃0.

［9］康道现,冉玉平,代亚玲,等.直接从病发提取DNA鉴定菌种诊治万博节皮菌所致脓癣［J］.临床皮肤科杂志,2013,42（6）:348⁃350.doi:10.3969/j.issn.1000⁃4963.2013.06.008.

［10］张晓利,吕雪莲,沈永年,等.菌落PCR技术快速鉴别丝状真菌的实验研究［J］.中华皮肤科杂志,2011,44（8）:556⁃559.doi:10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2011.08.009.