高效液相色谱法测定人血浆中左乙拉西坦的药物浓度

蔡 乐，朱 英，张明华，陈静静，柴 栋（解放军总医院药学部，北京 100853）

左乙拉西坦（levetiracetam，LEV）是一种吡咯烷酮衍生物，其化学结构与其他抗癫痫药物无相关性。LEV的抗癫痫机制尚不明确，有研究[1]发现其可与突触囊泡蛋白2A结合并抑制突触前膜钙通道，可能有选择性地抑制癫痫样突发放电的超同步性和癫痫发作传播的作用。LEV可用于成人、儿童及一个月以上婴幼儿癫痫部分性发作的加用治疗。LEV具有良好的药动学特性，其生物利用度高，蛋白结合率较低（＜ 10%），呈线性代谢特征，无肝酶诱导作用[2]。由于大部分LEV（约66%）以原型经肾脏排泄[3]，肾功能异常以及联合使用主要经肾脏排泄的药物可能会减慢其在体内的消除。因此对于特殊人群（如儿童、老年人、孕妇和肾功能不全患者）使用LEV后进行治疗药物监测可能有利于患者的个体化治疗，提高患者用药依从性。为此，本研究建立了人血浆中LEV的HPLC测定方法，旨为临床优化LEV的给药方案提供方法学基础。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂

左乙拉西坦对照品（S i g m a公司，批号：BCBS2739V），甲硝唑片（远大医药有限公司，批号：170216）。乙腈为色谱纯（Fisher公司），甲醇、二氯甲烷为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为实验用超纯水。

1.2 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、色谱工作站，美国Agilent公司）；TGL16M型医用离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；XW-80A旋涡混合器（上海弛唐实业有限公司）；AG-285型电子天平（瑞士Mettler公司）。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil BDS柱（4.6 mm×250 mm，5 µm，Thermo公司）；流动相：水-乙腈（87 : 13，v/v）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：205 nm；柱温：40 ℃；进样量：20 µL。

2.2 样品处理

2.2.1 血浆样品处理方法精密吸取待测血浆400µL置于1.5 mL带塞塑料离心试管，加入内标（200 μg·mL-1的甲硝唑溶液）50 µL，再加入600 µL乙腈，涡旋振荡1 min，12 000 r·min-1离心5 min，转移上清液900 µL于1.5 mL带塞塑料离心试管；加入二氯甲烷400 µL，涡旋振荡1 min，12 000 r·min-1离心5 min；吸取上清液200 µL于样品瓶中（注意不要触及下层有机相），20 µL进样分析。

2.2.2 标准曲线的制备精密称取左乙拉西坦对照品，用甲醇溶解配制成含左乙拉西坦为1.0 mg·mL-1的LEV储备液；取适量LEV储备液用空白血浆分别配制浓度为80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 µg·mL-1的LEV血浆标准溶液。按“2.2.1”项下方法进行样品处理和进样测定。以浓度（C）为横坐标，待测物与内标的峰高比（PHR）为纵坐标绘制标准曲线，并用SPSS统计软件进行加权线性回归计算。

2.2.3 质控样品取适量LEV储备液用空白血浆另行配制浓度为5.0、25.0和50.0 µg·mL-1三个浓度的质控样品溶液。将质控样品作为“未知样品”随机分散于血浆标准溶液和每批待测样品中测定。以每次的标准曲线计算出质控样品的浓度，以质控样品的测定浓度与标示浓度的比值考核方法学的精密度、重现性和回收率。

2.3 精密度与准确度

取3个浓度的质控样品各5份，组成一个分析批，按“2.2.1”项下方法处理后测定，计算批内RSD；连续3 d，运行3个分析批的质控样品，考察批间RSD；各浓度质控样品按未知样品随标准曲线同时测定，计算方法学回收率。

2.4 稳定性实验

取3个浓度的质控样品，置于– 20 ℃冰箱，经反复冻融3次，测定前放置室温平衡后，按“2.2.1”项下方法进行样品处理和进样，以此考察样品冻融稳定性；取质控样品于室温放置24 h，依“2.2.1”项下方法处理，考察样品室温放置稳定性；取质控样品，依照“2.2.1”项下方法处理后室温放置，于0、1、3、6、12、24 h测定，考察样品处理后放置稳定性。

3 结果

3.1 色谱行为

由图1可见，在205 nm波长下，样品图谱在LEV和内标出峰处背景干净，无明显杂峰干扰；LEV与内标峰形尖锐，与各杂峰分离良好。LEV与内标的保留时间分别为4.7 min和5.2 min。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

3.2 线性关系

在本方法条件下，LEV在2.5 ～ 80.0 µg·mL-1范围内具有良好的线性关系，线性方程为：PHR= 0.114 1C+ 0.115 3，r= 0.999 4。

3.3 精密度与方法学回收率

本方法的精密度和方法学回收率结果见表1，结果表明本方法的精密度和准确度良好。

表1 方法精密度和回收率实验结果Tab 1 The precision and recovery results of the method

3.4 稳定性考察结果

稳定性结果表明，LEV质控样品经反复冻融3次稳定性良好；LEV血浆样品室温放置24 h稳定；LEV血浆样品处理后，室温放置24 h稳定。

4 讨论

4.1 测定方法与线性范围的确定

文献报道，LEV治疗药物监测的方法有多种，包括HPLC、HPLC-MS/MS、免疫分析法等[4-7]。目前国内尚无市售的免疫学试剂盒方法监测LEV血药浓度，因HPLC的普及性较好，为此本研究建立了LEV的HPLC测定方法。有报道LEV的有效浓度范围为12 ～46 μg·mL-1[2-3]，本研究将线性范围设定为2.5 ～ 80.0 μg·mL-1，可涵盖此浓度范围，以满足临床日常监测LEV血药浓度的需要。

4.2 流动相的选择

本实验考察了流动相溶液pH与乙腈比例对LEV保留时间和分离的影响，发现流动相中乙腈比例对LEV和内标甲硝唑保留时间的影响较大，随着乙腈比例的升高，LEV和甲硝唑保留时间明显缩短。流动相溶液pH值虽然对LEV和甲硝唑的保留时间影响不大，但由于血浆样品中内源性物质的存在，使用磷酸盐缓冲液和乙腈为流动相时，LEV和甲硝唑受到了杂峰的干扰。为提高检测效率，缩短测定时间，经优化最终确定以水-乙腈（87 : 13，v/v）作为流动相。

4.3 样品处理方法的选择

文献报道，LEV测定时可选用液-液萃取和蛋白沉淀的方法处理血浆样品[5,8-9]。本实验发现蛋白沉淀方法操作较为简便、省时。在乙腈沉淀蛋白后，使用二氯甲烷或氯仿可将乙腈反提，除去脂溶性杂质，可进一步减少内源性杂质的干扰并提高方法的灵敏度。本实验分别考察了二氯甲烷和氯仿反提取乙腈的效果，发现使用二氯甲烷优于氯仿。为此，本研究对原有蛋白沉淀处理方法进行改进，以乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷反提取去杂质的方法处理血浆样品。

4.4 样品稳定性的考察

本实验稳定性考察结果表明，LEV在血浆中室温放置24 h稳定，经反复冻融3次稳定性良好。有报道显示LEV的全血样品在体外可经酯酶水解[3]，因此提示临床在采血后应尽快分离出LEV血浆样品，以减少全血样品水解而导致药物浓度降低。

综上，根据文献和本实验室客观条件，本研究建立了灵敏度高、简便易行的测定血浆中LEV的HPLC方法，为LEV血药浓度监测提供方法学基础，为临床根据血药浓度调整给药方案，促进合理用药提供依据。

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