线粒体DNA D-loop基因多态性与肾透明 细胞癌发病的相关性分析*

王天浩 闫飞 袁建林 魏迪 朱政 来东 李西安

(空军军医大学西京医院泌尿外科, 陕西 西安 710000)

肾透明细胞癌是临床常见的泌尿系恶性肿瘤之一，是肾脏恶性肿瘤最为常见的类型，恶性程度较高，且癌细胞容易脱落而转移，严重影响患者预后。近年其发病率呈逐年升高的趋势，因此，对其发病机制的研究成为学界和临床的焦点问题[1-4]。随着分子生物学的发展，多种肾透明细胞癌的相关肿瘤分子标志物被逐步确立，而作为细胞核外唯一的遗传物质线粒体DNA(mtDNA)，由于容易发生突变，其与癌症发病的联系受到重视[5-8]。D-loop在内的非编码区域是mtDNA多态性热点区域，据相关研究表明该区域与多种肿瘤的发病和预后有关[9-12]， 故本文探讨了线粒体DNA(mtDNA)D-loop基因多态性与肾透明细胞癌的关系，为临床研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年3月～2017年2月在我院治疗的肾透明细胞癌患者63例为观察组，其中男性39例，女性24例；年龄34～68岁，平均年龄(50.17±9.22)岁；纳入标准：①均经病理学诊断。②术前未接受化疗、放疗等治疗。③临床随访资料保存完整。排除标准：①不能随访者。②合并其他原发性肿瘤者。同时选取健康志愿者70例作为对照，其中男性40例，女性30例；年龄32～70岁，平均年龄(49.83±8.17)岁；观察组和对照组受试者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 实验方法

1.2.1 所有患者术前均空腹抽取外周静脉血，外周血标本当天提取DNA后置于-80℃恒温冰箱保存。

1.2.2 引物合成及PCR扩增 设计扩增 mtDNAD-loop区的引物没,上游引物：5'-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3'；下游引物：5'-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3'。引物合成和纯化均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。PCR 反应采用25μL 反应体积。反应程序：95℃预变性2min,95℃变形30s，55℃退火30 s，72℃延伸1min，38个循环，最后于72℃延伸 5 min。

1.2.3 DNA测序及结果分析 将 PCR 反应产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司，用 ABIPRISM 3100 DNA 序列分析仪对 PCR 扩增产物进行测序，利用 DNAman 软件分析肾透明细胞癌患者的mtDNAD-loop区序列，并与人mtDNA文库记录的剑桥序列(rCRS)进行比对，筛选出 mtDNAD-loop区的多态性位点。

1.3 统计学分析 统计分析采用SPSS19.0软件，样本代表性采用Hardy-Wenberg遗传平衡检验，计数资料比较使用t检验，生存曲线采用Kaplan-Meier描绘法，比较采用Log-rank检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mtDNAD-loop基因多态性位点分布 观察组和对照组mtDNAD-loop区共发现135个多态性位点，其中9个位点分布频率>5%，包括262、488、523、525、16293、16298、16304、16362和16519。根据Hardy-Wenberg遗传平衡检验，最后发现观察组和对照组262位点基因型频率分布符合Hardy-Wenberg定律，其样本代表性好，其余位点基因型频率分布不符合Hardy-Wenberg定律。

2.2 两组mtDNAD-loop区262位点基因型及等位基因频率比较 观察组和对照组mtDNAD-loop区262位点基因型及等位基因频率比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中观察组TT基因型及等位基因T频率分布为19.05%和38.89%，明显高于对照组(P<0.05)，见表1。

2.3 mtDNAD-loop区262位点多态性与临床病理特征的关系 不同性别、年龄、病理分级和临床分期肾透明细胞癌患者mtDNAD-lOOP区262位点基因多态性分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.4 mtDNAD-loop区262位点多态性与预后关系 截止2017年9月，CC基因型和CT基因型患者中位生存时间分别为40.40个月和40.20个月，明显高于TT基因型患者的34.81个月，比较差异有统计学意义(2=25.585，P<0.05)，见图1。

表2 mtDNA D-loop区262位点多态性与临床病理特征的关系[n(×10-2)] Table 2 The relationship between polymorphism of 262 locus in mtDNA D-loop region and clinicopathological features

图1 生存曲线图 Figure 1 Survival graph

3 讨论

线粒体是真核细胞的重要细胞器之一，是呼吸和氧化的中心，并且其携带了部分DNA,即线粒体DNA(mtDNA),是细胞核外唯一的遗传物质, 由16568个碱基对组成，含有3个基因，其中13个为蛋白质基因，2个为 rRNA基因， 22个为tRNA基因[13-15]。mtDNA处于活性氧及其他自由基包围之中，且缺乏相应组蛋白的保护以及完整的内修复系统，与核内基因组相比，mtDNA较易发生突变[16-17]。mtDNA的多态性热点区域主要集中在包括D-loop在内的非编码区域，D-loop区是mtDNA复制的调控区域，所以该区域DNA的复制和表达异常，往往与多种肿瘤的病发和预后具有相关性[18-20]。基因多态性是指由于单个核苷酸变异，引起染色体基因组水平上的DNA序列呈多态性，成为限制性片段长度多态性(RFLP)标志和微卫星标志发现后的第三代标志物，可能与多种肿瘤的病发和预后有关[21-22]。

3.1 mtDNAD-loop基因多态性位点分布分析 本文采用Hardy-Wenberg遗传平衡检验进行验证，现结果如下：观察组和对照组mtDNAD-loop区共发现135个多态性位点，根据Hardy-Wenberg遗传平衡检验，最后发现观察组和对照组262位点基因型频率分布符合Hardy-Wenberg定律，其样本代表性好，因此本文选用mtDNAD-loop区262位点基因型频率为研究对象。

3.2 两组mtDNAD-loop区262位点基因型及等位基因频率比较分析 mtDNAD-loop区的基因呈多态性，可能与肾透明细胞癌的发病有相关性，因此本文以262位点基因型及等位基因频率为指标，发现观察组和对照组mtDNAD-loop区262位点基因型及等位基因频率比较差异有统计学意义，其中观察组TT基因型及等位基因T频率分布明显高于对照组，结果具有统计学差异，这表明mtDNAD-loop区262位点TT基因及等位基因T与肾透明细胞癌的发病具有相关性，在一定程度上解释了肾透明细胞癌的在基因水平的部分发病机制。

3.3 mtDNAD-loop区262位点多态性与临床病理特征的关系分析 为了排除其他因素对mtDNAD-loop区262位点多态性与肾透明细胞癌相关性的干扰，本文研究了不同性别、年龄、病理分级和临床分期肾透明细胞癌患者mtDNAD-loop区262位点基因多态性分布，发现结果差异无统计学意义，表明了性别、年龄、病理分级和临床分期等因素与mtDNAD-loop区262位点多态性不具相关性，进一步确定了其与肾透明细胞癌发病密切相关。

3.4 mtDNAD-loop区262位点多态性与预后关系分析 据相关研究表明，mtDNAD-loop区262位点多态性与肾透明细胞癌的预后具有相关性，因此本文研究了二者的关系，发现CC基因型和CT基因型患者中位生存时间明显高于TT基因型患者，差异比较有统计学意义，这表明mtDNAD-loop区262位点TT基因型不利患者预后的改善，从而缩短患者的生存周期。

4 结论

本文探讨了mtDNAD-loop区262位点的多态性与肾透明细胞癌的关系，从基因水平对肾透明细胞癌的发病机制进行考察，显示肾透明细胞癌患者mtDNAD-loop区262位点携带等位基因T的频率明显升高，明确了mtDNAD-loop区262位点多态性与肾透明细胞癌发病的相关性。但其与临床病理特征无明显关系，有先进进一步研究。

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