GC-MS/MS测定山药中乐果等三种农药残留的一测多评研究

魏长勇,余敏灵

（乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山 614000）

中药材种植及中药饮片加工储存过程中农药的不当使用，均会影响其质量，严重危害人体健康[1]。《中国药典》2015年版四部收载了多种农药残留的气相色谱检查方法[2],近年来，对农药残留量研究报道的文献大多以气相、液相色谱或以其与质谱的联用为主[3-8],我们应用GC-MS/MS法根据色谱保留时间和质荷比信息对样品进行定性分析，以乐果二级离子扫描色谱峰(125.0/79.0)面积为参照，计算其与敌敌畏二级离子扫描色谱峰（185.0/93.0）面积和毒死蜱二级离子扫描色谱峰（313.9/257.9）面积的校正因子，建立GC-MS/MS测定山药[9]中乐果等三种农药残留的一测多评方法，收到了满意的结果，现将实验结果报道如下，以期为GC-MS/MS测定农药残留量提供一测多评[10-12]研究思路。

1 材料和方法

1.1 仪器与材料

GCMS-TQ8030气质联用仪(岛津中国科技有限公司)；Rxi-5SilMS，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm毛细管柱，工作站为LabSolutionsGCMSSolutions版本4.20(岛津中国科技有限公司);Cleanert TPH净化柱(天津博纳艾洁尔公司)。

乐果、敌敌畏、毒死蜱标准品溶液（规格：100μg·mL-1，批 号 ：乐 果 GSB05-2286-2016,敌 敌 畏GSB05-2298-2016,毒死蜱 GSB05-1849-2016，农业部环境监测保护研究所）。乙腈、丙酮均为色谱纯，氯化钠、无水硫酸钠均为优级纯。山药样品由四川龙马药业有限公司提供，按《中国药典》2015年版一部鉴定为山药（Dioscoreae Rhizoma），批号分别为20160527、20160602、20170613。

1.2 方法

1.2.1 测定原理

以乐果为对照品，利用样品色谱图中乐果色谱峰和敌敌畏色谱峰、毒死蜱色谱峰相对保留时间进行定位[2]；二级离子碎片图谱中乐果在47、62、79有碎片离子峰(丰度比为155∶13∶100，以79为参比)，敌敌畏二级离子碎片图谱中在63、93、109有碎片离子峰(丰度比为24∶100∶25，以93为参比)，毒死蜱二级离子碎片图谱中在194、258、286有碎片离子峰(丰度比为24∶100∶49，以258为参比)；通过定位和二级离子碎片图谱碎片离子峰以及其丰度比对乐果、敌敌畏、毒死蜱色谱峰进行定性分析。在定量分析时，通过精密量取乐果、敌敌畏、毒死蜱标准品溶液各适量，配制成不同浓度的混合溶液，按设定条件进样，记录色谱图，绘制乐果、敌敌畏、毒死蜱进样量对其峰面积的回归曲线，以乐果回归曲线斜率与敌敌畏、毒死蜱回归曲线斜率的比计算校正因子(fs/k=Ks/Kk)，通过乐果回归曲线计算乐果含量，通过校正因子及乐果回归曲线计算敌敌畏、毒死蜱含量。

1.2.2 测定条件

采用Rxi-5SilMS，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm毛细管柱，进样口温度：250℃；线速度：47.2cm/sec；程序升温：50℃保持1 min，以25℃/min速率升至125℃，再以10℃/min速率升至300℃，保持15 min。进样体积：1 μL。载气：高纯氦气(＞99.999%)。

离子源温度200℃；接口温度250℃；溶剂延迟时间5 min；碰撞气氩气（纯度大于99.999%）；电离方式见表1。

表1 电离方式

1.2.3 标准储备溶液的制备

精密量取乐果、敌敌畏、毒死蜱标准品溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，作为标准储备溶液（每1 mL含乐果、敌敌畏、毒死蜱各10 μg）。

1.2.4 样品溶液的制备

分别取三个批号山药样品（批号为20160527、20160602、20170613）约50 g，粉碎成粉末（过三号筛），分别取粉末约1 g，精密称定，置50 mL离心管中，加入15 mL乙腈，15 000r/min匀浆提取1 min，加入2 g氯化钠，再匀浆提取1 min，4 200 r/min离心5 min，取上清液于150 mL鸡心瓶中，再于离心管中加入15 mL乙腈，按上述方法重复匀浆提取一次，合并提取液，于40℃水浴旋转蒸发至约1 mL。Cleanert TPH固相萃取柱上加入约2 cm无水硫酸钠，用10 mL正己烷-丙酮(6∶4)预洗后，将样品浓缩液移入柱中，用25 mL正己烷-丙酮(6∶4)洗脱，收集洗脱液于40℃水浴旋转浓缩至近干，用丙酮定容至1 mL，0.2 μm滤膜过滤，即得。

1.2.5 样品加标溶液的制备

精密称取山药粉末1.020 1 g，按1.2.4项下样品溶液的制备方法，从“置50 mL离心管中起到收集洗脱液于40℃水浴旋转浓缩至近干”，加标准储备溶液5 μL，用丙酮定容至1 mL，0.2 μm滤膜过滤，即得。

1.2.6 专属性试验

精密量取标准储备溶液250 μL至5 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。按1.2.2项下测定条件，取对照品溶液、样品溶液、样品加标溶液分别进样，记录色谱图。

1.2.7 线性关系考察

精密量取标准储备溶液50、100、200、250、300、400、500 μL，分置7个5 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀。按1.2.2项下方法测定，以乐果二级离子扫描（125.0/79.0）峰面积A与乐果进样量m(ng)进行线性回归。

1.2.8 f值和t值的计算

通过以乐果回归曲线斜率与敌敌畏、毒死蜱回归曲线斜率的比计算校正因子（fsk=Ks/Kk），以保留时间比值计算t值。

1.2.9 精密度试验

精密量取标准储备溶液200 μL至5 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀。按1.2.2项下测定条件重复进样6次，测定峰面积。

1.2.10 稳定性试验

取1.2.5项下样品加标溶液，按1.2.2项下测定条件分别在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h进样，测定峰面积。

1.2.11 检出限与定量限

精密量取乐果、敌敌畏和毒死蜱标准品溶液各1 mL,用丙酮稀释制成乐果、敌敌畏和毒死蜱质量浓度各为10 μg·mL-1的单一成分溶液，分别精密量取上述单一成分1、0.1、0.1 mL,置同一10 mL量瓶中定容，逐级稀释，按1.2.2项下测定方法进样，以信噪比（S/N）的3倍计算最低检出限、10倍计算最低定量限。

1.2.12 回收率试验

精密称取1.2.4项下粉末9份，每份约1 g，分置9个50 mL离心管中，分为3组，每组3份，每组分别加标准储备溶液40 μL、50 μL、60 μL，按1.2.4项下方法制备样品溶液，取样品溶液按1.2.2项下测定条件分别进样，记录图谱，按回归方程A=615311 m-173计算供试品中乐果含量；按校正方程A敌敌畏=615311 mf敌敌畏/乐果-173计算敌敌畏含量，按校正方程A毒死蜱=615311 mf毒死蜱/乐果-173计算毒死蜱含量。

2 结果

2.1 专属性试验

在对照品溶液二级离子扫描色谱谱图中有乐果二级离子扫描(125.0/79.0)、敌敌畏二级离子扫描(185.0/93.0)和毒死蜱二级离子扫描(313.9/257.9)色谱峰，保留时间敌敌畏5.690 min、乐果10.663 min、毒死蜱13.191 min，在样品溶液色谱图中没有上述色谱峰，在样品加标溶液色谱图中有和对照品溶液色谱图中保留时间一致的乐果、敌敌畏、和毒死蜱二级离子扫色谱峰（见图1）；对照品溶液和样品加标溶液的二级离子碎片图谱中乐果在47、62、79处(丰度比：155∶13∶100，以79为参比)，敌敌畏在为63、93、109处(丰度比：24∶100∶25，以93为参比)，毒死蜱在194、258、286处(丰度比：24∶100∶49，以258为参比)，均有二级离子碎片峰（见图2）。

图1 二级离子扫描色谱图

图2 二级离子碎片图谱

2.2 线性关系

按实验测得乐果二级离子扫描峰(125.0/79.0)、敌敌畏二级离子扫描峰(185.0/93.0)、毒死蜱二级离子扫描峰(313.9/257.9）峰面积与各自进样量在0.1～1 ng范围内有较好的线性关系；得回归方程乐果为A=615 311 m-173,r=0.9 998(n=7)，敌敌畏为A=2 016 535 m-203，r=0.9 997(n=7)，毒死蜱为A=1 278 304 m-68，r=0.9 993(n=7)。

2.3 f值和t值的计算

计算得敌敌畏色谱峰峰面积和乐果色谱峰峰面积的校正因子f敌敌畏/乐果=2 016 535/615 311=3.277 3，相对保留时间t敌敌畏/乐果=5.690/10.663=0.533 6；毒死蜱色谱峰峰面积和乐果色谱峰峰面积的校正因子f毒死蜱/乐果=1 278 304/615 311=2.077 5，相对保留时间t毒死蜱/乐果=13.191/10.663=1.237 1。

2.4 精密度试验

测得乐果、敌敌畏、毒死蜱二级离子扫描色谱峰峰面积的RSD（n=6）分别为0.3%、0.7%、0.5%。

2.5 稳定性试验

结果表明，在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h时测得的乐果、敌敌畏、毒死蜱二级离子扫描色谱峰峰面积变化不大，RSD分别为0.8%、1.1%、0.7%。

2.6 检出限与定量限

结果表明，当取质量浓度为0.02、0.002和0.002 ng·μL-1的混合溶液进样分析时，测得乐果、敌敌畏、毒死蜱的信噪比（S/N）分别为27.52、35.10、32.26，计算得最低检出限（以进样量计）：乐果为2.18×10-3ng、敌敌畏为1.71 × 10-4ng、毒死蜱为1.86×10-4ng；最低定量限（以进样量计）：乐果为7.27×10-3ng、敌敌畏为5.70×10-4ng、毒死蜱为6.20×10-4ng。

2.7 回收率试验

结果表明，乐果平均回收率为99.3%，RSD为1.5%，敌敌畏平均回收率为99.4%，RSD为1.4%，毒死蜱平均回收率为99.6%，RSD为1.5%。

2.8 样品测定

样品测定结果显示：3批样品未检测出乐果残留量、敌敌畏残留量、毒死蜱残留量。

3 讨论

当色谱条件有细微改变时，相对保留时间有细微变化，但在该试验中，被测定物质的定性主要采用二级离子碎片峰及其丰度比确认，所以对相对保留时间的耐受性没有进行考察。

我们对多种药材农药残留的含量测定进行了研究，发现由于中药材含有多种成分，某些成分对测定会有一些干扰，所以在测定具体某一品种时应设计具体的试验参数，并进行相应方法学论证。

GC-MS联用法和GC-串联MS（MS/MS）联用法既具有GC的高分离效能，又具有MS可鉴定化合物结构的特点，可同时快速测定样品中多种残留农药及其衍生物。

我们采用的一测多评法是以一种对照品，建立该成分与其他成分间的相对响应因子，通过相对响应因子来计算其他成分含量的一种质量控制方法。该法具有成本低、效率高等优点，能有效解决多指标质量控制面临的对照品短缺、不易获得和检测成本相对昂贵等问题。

1. 孔令军，张娅婷，谷令彪，等.中药材农药残留的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2015,21(21):231-234.

2. 国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[M].北京:中国医药科技出版社,2015:209-223.

3. 程志，张蓉，刘韦华，等．气相色谱-串联质谱法快速筛查测定中药材中144种农药残留[J]．色谱，2014,1(32):57-68.

4. 达晶，王刚力，曹进，等.农药残留检测标准体系概述及其分析方法进展[J]．药物分析杂志，2014，5(34):760-769.

5. 殷玉杰，夏秀萍，毛福英，等.药用植物中农药残留检测技术的研究进展[J]．中国药房，2017，28(12):1 271-1 275.

6. 闫震，聂继云，徐国锋，等.超高效液相色谱-串联质谱法对比4种净化方式对不同色素含量基质中19种农药残留检测的影响[J]．分析测试学报,2014,33(9)：1000-1009.

7. 国金玲，张朔生.气相色谱-质谱联用技术在药品及食品分析中的应用[J]．中国药事，2016,30(6):560-563.

8. 刘娇，刘雪峰，樊宝娟.GC-MS法测定18种药材中的农药残留量[J]．西北药学杂质,2017,1(32):9-13.

9. 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京:中国医药科技出版社,2015:28-29.

10. 徐赛华，沈昱翔.一测多评法测定重楼药材中4种皂苷类成分含量[J].医药导报,2017,9(36):1 029-1 033.

11. 吕邵娃，于风明，苏红，等.中药材一测多评中相对校正因子的规范性文献调查和分析[J]．中国药房,2016,27(15):2 020-2 023.

12. 陈杨，徐光临，徐德生，等.一测多评法在中药质量中的控制及关键问题[J]．环球中医药,2017,10(5):635-640.