miR-145下调c-Myc基因抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖

蔡延森，曾永秋，马明义，税清林，赵 矫

（西南医科大学医学细胞生物学与遗传学教研室，四川泸州 646000）

微小RNA（micro RNA，miR）是一类广泛存在于真核细胞中的长度为21～25 nt的内源性非编码单链RNA分子[1]，人类基因组中估计约有1000种miRNA，进化上均相当保守[2]。它们可以与特定靶基因mRNA 3'-UTR区完全或部分互补结合，降解靶基因的mRNA或抑制其翻译，从而阻断靶基因的表达[2]。

miR-145位于人类第5号染色体（5q32），其前体具有茎环结构，经剪切加工可形成miR-145-3p和miR-145-5p两种片段。miR-145属于抑癌基因，可直接作用于c-Myc、IRS-1等癌基因，从而抑制肿瘤细胞生长并促进细胞凋亡。文献报道在多种肿瘤，如肺癌、食管癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、结直肠癌、卵巢癌等中，miR-145表达明显降低[3-9]。最近有研究显示，非小细胞肺癌、直结肠癌中过表达miR-145均可抑制肿瘤细胞的增殖[5，10-13]，提示miR-145可作为抗肿瘤的一种手段。

目前，乳腺癌的发病率在恶性肿瘤中居全球第二，在发展中国家的女性肿瘤患者中居第一[1]。针对乳腺癌细胞miR-145的表达水平以及其与下游目的基因之间的关系的研究较少。本研究采用化学合成miR-145-3p和miR-145-5p，体外转染人乳腺癌细胞MCF-7，通过检测MCF-7细胞系中c-Myc mRNA表达变化以及细胞的增殖情况，初步探讨人乳腺癌细胞MCF-7中miR-145与c-Myc表达的关系及miR-145在乳腺癌发生过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人乳腺癌MCF-7细胞购自西南医科大学临床医学实验中心。miR-145-3p、miR-145-5p由锐博生物制备。设计正反向引物及内参正反向引物，由Invitrogen合成。细胞转染脂质体LipofectamineTM2000，RNA提取试剂盒TRIzol购自Invitrogen。凋亡试剂盒Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit购自凯基，CCK-8购自日本同仁化学研究所。

1.2 细胞传染

常规培养（RPMI）1640培养基，10%小牛血清）乳腺癌MCF-7细胞，按4×105个细胞/孔进行接种于6孔板，培养至细胞融合度约为60%。实验分为四个组：miR-145-3p组（3p组）、miR-145-5p组（5p组）、阴性对照组（空脂质体）、空白对照组（不转染）。转染实验组细胞的LipofectamineTM 2000脂质体以无血清、无双抗Opti-MEM按每孔5μL脂质体分别转染10μL miR-145-3p或miR-145-5p。

1.3 CCK-8法检测细胞的增殖抑制情况

将MCF-7细胞按每孔5×103个细胞的浓度接种于96孔板，每组分别设6个复孔，培养24 h后根据分组情况转染对应的脂质体。转染24、48、72 h后检测各组细胞增殖情况。加入CCK-8，继续培养4 h后用酶标仪测定450 nm波长OD值。以OD值为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线图，计算细胞增殖抑制率。计算公式：细胞增殖抑制率＝（1-实验各组OD值/空白组OD值）×100%。

1.4 RT-PCR检测转染后各组细胞c-Myc mRNA表达水平

于转染后72 h使用TRizol提取各组细胞中总RNA。根据Choi等[14]合成引物进行RT-PCR扩增，目的基因为c-Myc长度102 bp的片段，正反向引物为：F:5’-GGCCCCAAGGTAGTTATCCTT-3’，R:5’-CGTTTCCGCAACAAGTCCTCT-3’。内 参 GAPDH基因扩增片段长度为250 bp，正反向引物为：F:5’-A AGGGCATCCTGGGCTACAC-3’，R:5’-AGGGTCTC TCTCTTCCTCTTGTG-3’。RT-PCR按两步法试剂盒进行，反应程序为：94℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 25 s，循环28次；72 ℃ 5 min 。扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳，用紫外凝胶成像分析仪照相并用Image Lab 4.0软件扫描分析。重复3次。

1.5 统计学处理

使用SPSS17.0统计软件处理各组数据，以x±s表示计量资料，进行多样本均数两两比较的q检验方差分析。

2 结果

2.1 各组细胞增殖情况

与空白组和阴性对照组比较，5p组MCF-7细胞在24～72 h范围内增殖抑制率平均为56%（24 h抑制率42%，48 h抑制率60%，72 h抑制率61%），差异显著（P＜0.05）；3p组MCF-7细胞增殖抑制率平均为10%（24 h抑制率14%，48 h抑制率10%，72 h抑制率11%），差异则无显著性(P＞0.05)。

图1 乳腺癌MCF-7细胞的生长曲线

2.2 各组细胞c-Myc mRNA表达水平

5p组、3p组、阴性对照组、空白组MCF-7细胞转染72 h后，c-Myc mRNA的表达量分别为11.12±0.09，31.05 ± 0.05，63.64 ± 0.11，59.49 ± 0.08（图2）。RT-PCR结果显示与阴性对照组和空白组相比，5p组和3p组细胞中c-Myc mRNA的表达量均出现下调，分别下降了约82%和50%（P＜0.05）。

图2 RT-PCR检测miR-145转染72 h后细胞中c-Myc mRNA表达

3 讨 论

miR-145属于抑癌基因，其表达量在正常乳腺细胞中高于乳腺癌细胞；而c-Myc是癌基因，其表达量在正常乳腺细胞中低于乳腺癌细胞。目前，肿瘤的基因治疗可以从两个方面开展工作：一是将癌基因特异性敲除、沉默或下调其表达，从而抑制肿瘤生长；二是将抑癌基因的重新导入细胞，上调其表达来对抗肿瘤、促使其凋亡[15-17]。无论是基因的敲出/沉默还是重新导入，均需要构建高效可靠的表达体系。本研究通过化学方法合成的miR-145表达体系制备快捷且能在细胞中稳定过表达，可弥补腺病毒/慢病毒载体法等传统导入方法瞬时转染持续时间短的不足，可高效稳定的导入MiR并沉默靶基因。

miR-145 mRNA的两种片段3p和5p，在细胞中的功能不尽相同。已有研究表明，在非小细胞肺癌、直结肠癌细胞中，miR-145-5p受P53直接激活，然后作用于c-Myc抑制其表达，进而使细胞停止生长并促使细胞凋亡，但miR-145-3p则几乎没用作用[7、18]。在乳腺癌中，miR-145的两种片段是否调控c-Myc基因，它们在功能上是否存在差异，目前尚不清楚。

本研究构建的3p和5p表达体系在体外转染乳腺癌MCF-7细胞后，结果显示，与阴性组和空白组相比，3p组细胞中虽然c-Myc mRNA的表达量下降约50%，但细胞的增殖只受到微弱抑制（平均约为10%）；而5p组细胞中不仅c-Myc mRNA的表达量下降更显著（约82%），且细胞生长受到了明显抑制（约56%）。本研究发现乳腺癌MCF-7细胞中miR-145的两种片段均可作用于c-Myc基因，但5p片段对细胞增殖的抑制效果显著，而3p片段则较不显著。

miR-145两种片段之所以会有这样的差异，可能是由于它们不仅共同作用于c-Myc基因，还同时分别作用于多个不同的靶基因来调控细胞导致的。这些靶基因对乳腺癌细胞的生长调控，以及miR-145与它们的关系和影响将是我们下一步的研究方向。本研究针对性的结合了miRNA和肿瘤基因治疗两大热点领域，构建了一种安全可靠的miR-145表达体系并运用于乳腺癌细胞使其下调原癌基因的高表达，为肿瘤基因治疗提供一种新的研究策略。

1. Chacon-Cortes D，Smith RA，Haupt LM，et al.Genetic association analysisofmiRNA SNPsimplicates MIR145 in breast cancer susceptibility[J].Bmc Medical Genetics，2015，16(1):1-11.

2. 王小昆，张玉成，吴晓冬.miRNA在结直肠癌中的研究现状[J].中国实验诊断学，2017，21(8):1 471-1 475.

3. Takagi T，Iio A，Nakagawa Y，et al.Decreased expression of microRNA-143 and-145 in human gastric cancers[J].Oncology，2009，77(1).12-21.

4. Kano M，Seki N，Kikkawa N，et al.miR-145，miR-133a and miR-133b:Tumor-suppressive miRNAs target FSCN1 in esophageal squamous cell carcinoma[J].Int J Cancer，2010，127(12):2 804-2 814.

5. 张伟，刘伟良，王勇，等.miR-145在非小细胞肺癌中的表达[J].现代肿瘤医学，2017，25(15):2 424-2 427.

6. AkaoY,Nakagawa Y,Naoe T.microRNA-143 and-145 in colon cancer[J].RNA&Ceu Biology,2007,26(5):311-320.

7. Sachdeva M，Zhu S，Wu F，et al.p53 represses c-Myc through induction of the tumor suppressormiR-145[J].Proceedings of the National Academy of Sciemes 2009,106(9):3 207-3 212.

8. 赵燕，郝燕妮，刘南京，等.miR-145通过下调PLCε抑制膀胱癌EMT和迁移及其机制研究[J].中国生物工程杂志，2017，37(3):27-36.

9. 孙厚良，梅学英，付春玲，等.宫颈癌患者癌组织miR-145表达及意义 [J].山东医药，2017，57(12):61-62.

10.Yin R，Zhang S，Wu Y，et al.microR-145 suppresses lung adenocarcinoma-initiating cell proliferation by targeting OCT4[J].Oncology Reports，2011，25(6):1 747-1 754.

11.Cho WC，Chow AS，Au JS.MiR-145 inhibits cell proliferation of human lung adenocarcinoma by targeting EGFR and NUDT1[J].RNA Biology，2011，8(1):125-131.

12.Zhe C，Huazong Z，Yong G.et al.miR-145 inhibits non-small cell lung cancer cell proliferation by targeting c-Myc[J].Journal of Experimental&Clinical Cancer Research，2010，29:151.

13.Shi B，Sepp-Lorenzino L，Prisco M，et al.Micro RNA 145 targets the insulin receptor substrate-1 and inhibits the growth of colon cancer cells[J].Journal of Biological Chemistry,2007,282(45)32 582-32 590.

14.Choi MH，Noh WC，Park JW，et al.Gene expression pattern during osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells in vitro[J].Journal of Periodontal&Implant Science，2011，41(4):167-175.

15. Krutzfeldt J，Rajewsky N，Braich R，et al.Silencing of microRNAs in vivo with‘antagomirs’ [J]． Nature，2005，438(7 068):685-689.

16.Si ML，Zhu S，Wu H，et al.miR-21-mediated tumor growth[J].Oncogene，2007，26(19):2 799-2 803.

17. Liang Z，Wu H，Reddy S，et al.Blockade of invasion and metastasis of breast cancer cells via targeting CXCR4 with an artificial microRNA[J].Biochemical&Biophysical Research Communication,2007,363(3):542-546.

18. Koscianska E,Baev V,skreka K,et al.Prediction and preliminary validation of oncogene ragulation by miRNAs[J].BMC Molecular Biology,2007,8(79):1-14.