在线固相萃取-液质联用法检测太湖水体微囊藻毒素技术研究

姜 晟，郁建桥，钟 声，董南巡，许志波，沈 斐

1.江苏省环境监测中心，江苏 南京 210036 2.江苏省太湖野外水质与蓝藻综合观测站，江苏 苏州 215164 3.苏州科技大学环境科学与工程学院，江苏 苏州 215009 4.无锡市环境监测中心站，江苏 无锡 214023

太湖地处长江中下游平原，水域面积约2 338 km2，是我国第三大淡水湖[1]。太湖富营养化问题从20世纪80年代开始加剧[2]，突出表现为蓝藻水华频发，水环境质量变差。2007年一度导致无锡市饮用水危机，引起了国内外的广泛关注[3]。蓝藻释放的微囊藻毒素(MCs)具有肝脏毒性和神经毒性[4]，对肾、肾上腺、肺、胃等器官也有不同程度的损害[5]。微囊藻毒素是具有生物活性的单环七肽化合物，含有2个可变的氨基酸基团，组合形成多种异构体，目前研究较多的为MC-LR、MC-RR、MC-YR 3种(L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸、色氨酸)[6]。世界卫生组织(WHO)和中国《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)、《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)已经明确规定了水中MC-LR的浓度限值[7-9]，同时将高效液相色谱法作为推荐的标准分析方法[10]。

近年来，随着检测仪器与分析技术的不断进步，水体微囊藻毒素分析方法不断推陈出新[11-13]，在线固相萃取-液相色谱串联质谱技术逐步被用于环境监测工作中，郭娟[14]、张春燕[15]、施俭[16]等先后研究并应用该项技术对标准样品、水源水、饮用水中的微囊藻毒素含量进行了检测分析，证明了该方法适用于水中痕量微囊藻毒素的连续、在线、实时监测。与传统分析方法相比[17]，在线固相萃取-液质联用法的自动化程度高、定性定量准确、分析效率大幅提升，水样的在线净化、富集以及随后的全自动分析过程显著降低了背景噪声和人为操作对分析结果的影响，提高了方法检出限和分析结果的可靠性与重现性，简化了水样预处理的步骤流程。但由于仪器本身购置和运行成本较高，微囊藻毒素也并非现行地表水环境质量标准基本项目，所以目前在国内尚未得到广泛应用，针对自然水体中实际样品开展长期连续检测分析的研究报道则更为少见。江苏省太湖野外水质与蓝藻综合观测站作为太湖流域水环境监测站网的前沿枢纽，更加关注蓝藻水华监测技术发展动向，于2016年首次使用在线固相萃取-液质联用法对太湖水体微囊藻毒素含量进行了为期一年的连续观测和分析，将方法研究与业务应用紧密结合，针对太湖实际水样摸索建立了一套稳定高效、准确可行、相对先进的地表水微囊藻毒素分析方法，并且开展了长时段、大规模的实际水样检测分析，取得了较为令人满意的效果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：在线固相萃取-超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱系统(UPLC H-Class Xevo TQD，美国)。

滤膜：亲水性聚丙烯滤膜(Acrodisc Syringe Filter 13 mm 0.2 μm GHP，美国)。

试剂：甲醇(UPLC级，99.95%，中国)，丙酮(GC级，≥97%，德国)，正己烷(HPLC级，≥98%，德国)，甲酸(色谱级，≥98%，中国)，氨水(色谱级，≥25%，中国)，乙腈(GC级，99.8%，德国)，所有试剂使用时未经其他操作。

标准样品：微囊藻毒素-LR标准物质(纯度95%，农业部环境保护科研监测所，出厂日期为2015-10)，微囊藻毒素-RR标准物质(纯度95%，农业部环境保护科研监测所，出厂日期为2015-12)，微囊藻毒素-YR标准物质(纯度≥95%，Enzo Life Sciences公司，美国,出厂日期为2016-01)；标准储备液：MC-LR、MC-RR、MC-YR均为2 μg/mL，标准使用液：使用时用超纯水稀释成浓度为0.01～50 μg/L 的混合标准溶液。

1.2 样品采集与预处理

2016年2—12月，开展太湖水体微囊藻毒素观测工作，在全湖共布设点位24个(图1)，监测频次为每月1次，采样深度为水面与水下0.5 m，采水器采集水样后倒入500 mL棕色广口瓶，密闭并置于船舱阴凉避光处妥善保存。返回实验室即进行预处理，利用一次性针孔注射器配合亲水性聚丙烯滤膜对水样进行过滤[12]，滤后样品取15 mL于Waters专用进样小瓶中，单次分析进样量为5 mL。

图1 太湖水体微囊藻毒素监测点位分布Fig.1 Distribution monitoring points in Taihu Lake

1.3 色谱-质谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC ©BEH C18色谱柱(2.1×50 mm，1.7 μm)；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：含0.5%甲酸的乙腈-甲醇混合溶液(体积比为90∶10)；柱温：50 ℃；进样体积：5 mL。采用梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions

电喷雾离子源正离子扫描(ESI+)，多反应监测(MRM)模式，毛细孔电压:3.5 kV，离子源温度:150 ℃，去溶剂气温度：450 ℃，去溶剂气(氮气)流速：900 L/h，锥孔气(氮气)流速：50 L/h。其他质谱分析参数见表2，标准品色谱图见图2。

表2 3种MCs的质谱分析参数Table 2 MS/MS parameters of 3 MCs

图2 3种MCs多反应监测离子流与总离子流色谱图(3种物质浓度为1 μg/L)Fig.2 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatogram of 3 MCs and total ion chromatogram(T1C) (concentration of three substances:1 μg/L)

1.4 在线固相萃取条件

在线SPE柱：Waters Oass® HLB Direct connect HP 20 μm(2.1 mm×30 mm)；进样量5 mL；流动相A：0.2%氨水溶液，流动相B：0.5%甲酸水溶液，流动相C：0.5%甲酸的乙腈-甲醇混合溶液(体积比为90∶10)，流动相D：甲醇-正己烷-丙酮混合溶液(体积比为33∶33∶33)，梯度洗脱条件见表3。

表3 固相萃取洗脱条件Table 3 SPE elution conditions

2 结果与讨论

2.1 方法的验证

2.1.1 线性范围和检出限

配制MCs浓度分别为0.05、0.1、1、10、50 μg/L混合标准溶液，以目标物的峰面积为纵坐标、质量浓度(μg/L)为横坐标，绘制工作曲线，得到线性回归方程，相关系数均大于0.99，各目标化合物在线性浓度范围内呈现良好的线性关反射率拟合模型系。根据环境监测分析方法检出限[18]可知，该方法检出限符合并优于世界卫生组织(WHO)和《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)的限值要求(1.0 μg/L)。方法检出限计算公式如下：

MDL=S×t(n-1,0.99)

(1)

式中：MDL为方法检出限，n为样品的平行测定次数，S为n次测定结果的标准偏差，t为自由度为(n-1)、置信度为99%时的t分布的单边临界值;当n=7时，t为3.143。结果见表4。

表4 3种MCs线性关系、相关性系数、线性范围、检出限Table 4 Linear regression equations, correlation coefficients and detection limits for 3 MCs

2.1.2 回收率和精密度

在湖水样品中分别添加0.05、1、20 μg/L 3种不同浓度的混合标准溶液，按照上述方法进行前处理，每个水样平行测定6次，计算回收率、精密度，结果见表5。可见，低、中、高3个浓度的样品回收率为85.40%～115.44%，相对标准偏差小于7%，表明该分析方法具有较好的回收率、精密度，在实际水样检测方面具有良好的适用性、可信度。

表5 3个加标水平下3种MCs的回收率和精密度(n=6)Table 5 Recoveries and RSDs of 3 MCs from surface water of Taihu lake

2.2 结果分析

1)全部水样均未发现藻毒素超标现象。3种微囊藻毒素中，MC-LR全湖年均值为0.166 μg/L，全年最大值为0.756 μg/L，未超过《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)及《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)限值(1.0 μg/L)要求；MC-RR全湖年均值为0.089 μg/L；MC-YR全湖年均值为0.126 μg/L。

2)由图3可见，全年各月藻毒素浓度变化趋势:7月太湖水体中MC-LR、MC-YR 2种藻毒素含量为全年最高，MC-RR全湖月均值最高的月份为3月、次高为7月，2月3种藻毒素含量皆为全年最低，其他各月有所波动。总体而言，与蓝藻水华暴发、消亡时间规律保持一致。

3)将太湖各湖区检测结果进行比较，由图4可以发现，西部沿岸是太湖水体藻毒素含量较高的水域。受蓝藻光合作用特性影响，表层水体的藻毒素含量与水下0.5 m样品相比也相对更高。这2个特点均与太湖蓝藻水华的水平和垂直空间分布规律保持一致[19]。

图3 2016年太湖水体MCs变化趋势Fig.3 Trends of Microcystins in Taihu Lake in 2016

图4 2016年太湖水体MCs空间分布状况Fig.4 Spatial distribution of Microcystins in Taihu Lake in 2016

3 结语

提出并建立了一种适用于太湖的水体微囊藻毒素分析检测方法，该方法灵敏度高、前处理步骤简单、检测时间短，线性关系、回收率、重现性等方法学指标较好，检出限优于现行国际、国内标准要求，十分符合太湖水环境质量监测需要。

利用该方法对2016年2—12月太湖24个监测点位的实际水样进行检测。结果表明，样品中水体微囊藻毒素未检测到超标现象，全湖藻毒素含量7月最高、2月最低，西部沿岸藻毒素含量高于其他各主要湖区，表层水体藻毒素含量相对更高，藻毒素浓度及变化趋势与蓝藻水华生长分布规律密切相关。

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