孟鲁司特钠对ITP模型小鼠T淋巴细胞亚群及晚期氧化蛋白产物的影响①

邢丽娜 任金海 王 颖 王福旭 温树鹏 郭玉洁

(河北医科大学第二医院血液内科，石家庄 053600)

特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是临床上常见的出血性疾病，由毛细血管发生炎症反应产生病变，属于自身免疫性疾病[1]。免疫功能紊乱、血小板数量减少为ITP的主要症状，临床上采用孟鲁斯特钠治疗[2,3]。晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products,AOPP) 作为一种具有促炎症活性的物质，能引起巨噬细胞和单核细胞增殖，诱导TNF-α等促炎性细胞因子合成、分泌，促发机体免疫炎症反应的发生[4]。目前关于孟鲁斯特钠对AOPP相关影响的研究尚未发现，因此本研究主要通过建立ITP模型小鼠，探讨孟鲁斯特钠对机体免疫的影响与AOPP的影响，以阐明孟鲁斯特钠治疗ITP的机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级BALB/c小鼠，体重18～22 g，雄性，购自南方医科大学实验动物中心。

1.1.2试剂 T淋巴细胞亚群试剂盒与CD3-FITC/CD4-APC/CD8-PE荧光素标记的单克隆抗体(北京同生时代生物技术有限公司)；IL-6、TNF-α试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)；AOPP试剂盒(北京西美杰科技有限公司)；水为超纯水。

1.1.3仪器 酶联免疫检测仪(美国宝特公司)；流式细胞仪(艾森生物有限公司)；离心机(湖南湘鑫仪器仪表有限公司)；细胞分析仪(贝克曼库尔特公司)。

1.2方法

1.2.1ITP模型的建立[5]于造模第1、3、5、7天腹部注射豚鼠抗BALB/c小鼠血小板血清(APS)，剂量为200 μl/20 g，建立小鼠 ITP 模型。以小鼠外周血小板降低至正常值25% 视为造模成功。

1.2.2动物分组与给药 将40只雄性BALB/c小鼠随机分为4组，分别为对照组、模型组、孟鲁司特钠低剂量组、孟鲁司特钠高剂量组，每组10只。于造模后第8天开始给药。对照组不作造模处理，灌胃给予等体积生理盐水；模型组灌胃给予等体积生理盐水；孟鲁司特钠低剂量组灌胃给予孟鲁司特钠，剂量为3 mg/kg；孟鲁司特钠高剂量组灌胃给予孟鲁司特钠，剂量为12 mg/kg。给药剂量按成人临床用量按表面积比等效量计算，给药体积为20 ml/kg体重，于每日按时给药1次，连续给药14 d。

1.2.3胸腺、脾脏指数的测定 各组小鼠于给药后第15天称重后，眼眶取血后，处死小鼠，剖开胸腔及腹部，取出胸腺、脾脏，用生理盐水清洗后，滤纸吸去水分，称重，分别计算各组小鼠的胸腺指数、脾脏指数，公式如下：胸腺指数=胸腺湿重(mg)/小鼠体重(g)；脾脏指数=脾脏湿重(mg)/小鼠体重(g)。

1.2.4外周血小板计数 分别于造模后第8天，给药后第15天通过尾静脉取小鼠外周血，采用细胞分析仪进行血小板计数。

1.2.5外周血T淋巴细胞亚群的测定 各组小鼠眼眶取血约0.5 ml，加入肝素100 μl抗凝血，加入PBS缓冲液适量，1 500 r/min离心10 min 后，取上层血浆，然后2 500 r/min离心10 min，沉淀分离细胞，加入PBS缓冲液 0.1 ml制备单细胞悬液，分别加入CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE 2.5 μl于同一上样管，同时设立不加任何抗体的对照组，放置10 min后，加入5 ml红细胞溶解液，放置15 min，于2 500 r/min离心20 min，去上清液，加入PBS缓冲液，洗涤细胞2次，固定，采用流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+水平。

1.2.6血清IL-6、TNF-α、AOPP的测定 各组小鼠眼眶取血约0.5 ml，静置15 min，于离心机2 500 r/min下离心15 min后，分离血清，采用酶联免疫吸附法检测IL-6、TNF-α、AOPP水平。于96孔板中，分别加入标准品、样品稀释液和待测样品100 μl，于37℃下放置60 min，洗涤，加入抗小鼠IL-6、TNF-α、AOPP抗体100 μl，37℃ 放置60 min，洗涤，加HRP标记的亲和素100 μl，于37℃放置30 min，洗涤，加底物工作液(TMB) 100 μl，37℃避光放置15 min，加终止液100 μl。置于酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度(OD值)，根据标准曲线计算样品中小鼠IL-6、TNF-α、AOPP含量。

2 结果

2.1孟鲁司特钠对血小板计数的影响 造模后第8天，与对照组小鼠比较，各组小鼠的血小板计数均显著下降(P<0.05)；同一组小鼠给药后第15天与造模第8天比较，孟鲁司特钠低、高剂量组小鼠的血小板计数显著升高(P<0.05)，且高剂量组小鼠血小板升高程度更明显；给药第15天后，与模型组比较，孟鲁司特钠低、高剂量组小鼠血小板计数显著升高，结果见表1。

2.2孟鲁司特钠对胸腺指数、脾脏指数的影响 与对照组比较，模型组小鼠的胸腺指数、脾脏指数均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，孟鲁司特钠低、高剂量组小鼠胸腺指数、脾脏指数显著降低(P<0.05)，结果见表2。

GroupsnPLT(×109 L-1)8 d afterestablish model15 d afterestablish modelControl group10109.40±34.05 114.85±40.28 Model group1032.78±5.981)29.45±6.321) Low dosage group1028.32±6.901) 64.26±15.921)2)3)High dosage group1029.99±5.371)95.30±20.552)3)

Note：PLT.Platelet count.Compared to control group，1)P<0.05;compared to model group，2)P<0.05;compared to 8th day after building ITP model，3)P<0.05.

GroupsnCD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+Control group1065.64±5.3842.37±5.2722.80±3.871.92±0.22Model group1055.77±4.751)29.86±3.951)31.86±4.861)0.94±0.251)Low dosage group1060.20±7.462)36.22±2.402)25.95±3.042)1.43±0.192)High dosage group1062.84±6.222)39.35±4.172)22.96±4.932)1.71±0.312)

Note：Compared to control group，1)P<0.05;compared to model group，2)P<0.05.

GroupsnIL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)AOPP(pg/ml)Control group1089.09±13.5785.64±11.0968.93±9.36Model group10136.47±10.741)124.42±13.741) 85.23±12.521)Low dosage group10104.84±16.842)110.20±16.752)73.43±8.392)High dosage group1092.11±15.482)90.53±12.742)65.84±9.822)

Note：Compared to control group，1)P<0.05;compared to model group，2)P<0.05.

GroupsnThymus index(mg/g)Spleen index(mg/g)Control group101.82±0.633.54±0.90Model group103.21±0.931)5.10±1.231)Low dosage group101.99±0.682)3.99±1.172)High dosage group101.77±0.722)3.34±1.042)

Note：Compared to control group，1)P<0.05;compared to model group,2)P<0.05.

2.3孟鲁司特钠对外周血T淋巴细胞亚群的影响 与对照组比较，模型组小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+显著降低(P<0.05)，CD8+显著上升(P<0.05)；与模型组比较，孟鲁司特钠低、高剂量组小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+显著上升(P<0.05)，CD8+显著下降(P<0.05)。结果见表3。

2.4孟鲁司特钠对血清IL-6、TNF-α、AOPP的影响 与对照组小鼠比较，模型组小鼠IL-6、TNF-α、AOPP水平显著升高(P<0.05)；与模型组小鼠比较，孟鲁司特钠低、高剂量组小鼠IL-6、TNF-α、AOPP水平显著降低(P<0.05)。结果见表4。

3 讨论

ITP是一种过敏性免疫疾病，主要表现为血小板的减少。本研究中，注射APS建立小鼠ITP模型8 d后，各组小鼠外周血小板数量均显著下降，说明该方法可以成功复制ITP动物模型。脾脏指数和胸腺指数可以准确反映出机体的免疫能力，通过测定各组小鼠的脏器指数，结果表明ITP机体免疫功能异常，通过服用孟鲁司特钠可恢复到正常水平。此外，孟鲁司特钠可升高血小板的数量。

CD3+是成熟T淋巴细胞表面标志，CD4+为T辅助淋巴细胞，在机体免疫中起辅助作用，CD8+T为T杀伤细胞，起免疫抑制作用。血小板表面膜蛋白被抗原获取后，专递给CD4+T细胞，并活化B淋巴细胞，产生血小板抗体，因此，辅助T淋巴细胞在紫癜治疗过程中发挥重要作用[6,7]。通过检测T淋巴细胞亚群和细胞因子，发现ITP模型小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平显著下降，表明ITP导致辅助T细胞和抑制T细胞比例失调，T淋巴细胞表达异常，服用孟鲁司特钠能够使T淋巴细胞亚群比例恢复平衡。采用Pearson相关性分析，结果表明血小板数与CD3+、CD4+呈现负相关。

AOPP是一类尿毒症毒素，是血清白蛋白被自由基和反应性氧系氧化后的产物，能够激活单核细胞和中性粒细胞，刺激单核细胞和巨噬细胞产生IL-6。IL-6 作为炎症介质及抗原诱导物，可使促进抗体分泌，参与自身免疫疾病的发生和发展全过程，活化的单核细胞是其主要来源[8]。此外，IL-6 能通过促进B细胞的成熟而分泌IgG、IgA、IgE等细胞因子，诱导炎症反应[9]。AOPP还能刺激肿瘤坏死因子(TNF-α)合成、释放[10]。TNF-α被激活后，激活中性粒细胞及巨噬细胞，增加其细胞毒性，释放更多细胞因子IL-6和其他细胞炎性因子，加快炎症进程。结果表明，模型组小鼠AOPP、IL-6、TNF-α水平均显著升高，服用孟鲁司特钠后显著下降，相关性分析结果显示AOPP上升与IL-6、TNF-α水平上升呈现正相关。

ITP主要通过刺激机体免疫系统，使T淋巴细胞亚群失衡，积累OAPP，刺激IL-6、TNF-α等炎性细胞因子产生，刺激B细胞产生抗血小板抗体，损伤血小板。孟鲁司特钠可通过免疫调控作用,修复机体免疫系统，增强机体对抗原的清除能力，调整T淋巴细胞亚群平衡，减少OAPP积累，抑制血小板抗体分泌，减少血小板损伤破坏。此外，降低血清中IL-6、TNF-α等炎性因子的含量，可以进一步降低血管内皮细胞通透性，治疗出血症。

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