总胆固醇测定试剂盒审评要点概述

叶朝付 寇艳芹 杨笑鹤 甄辉 浙江省医疗器械审评中心 （浙江 杭州 310012）

总胆固醇是指血液中各脂蛋白所含胆固醇之总和，临床上主要用于高胆固醇血症的辅助诊断。影响总胆固醇水平的主要因素有：年龄，性别，饮食习惯，遗传因素等。目前，检测总胆固醇的方法主要包括化学法、酶法、色谱法、同位素稀释质谱法等，其中胆固醇氧化酶法是现阶段临床应用最为广泛的常规测定方法。据不完全统计，国家食品药品监督管理总局目前对外公开已注册总胆固醇产品信息约150条（含进口注册产品信息），生产企业覆盖北京、上海、广东、浙江、四川等各省市。

该产品已有相应行业标准YY/T 1206-2013《总胆固醇测定试剂盒（氧化酶法）》发布并实施，现结合YY/T 1206-2013、2016年新修订版《中国成人血脂异常防治指南》以及省内已上市产品情况，对行标中线性范围、空白样本等未做明确规定的条款以及准确度试验方法与现行其他标准不一致等情况进行明确和细化，并简要概述胆固醇氧化酶法产品的审评要点，期望能够为注册申请人准备注册资料提供参考。

1.适用范围

总胆固醇测定试剂盒是指利用胆固醇氧化酶法对人血清、血浆样本中总胆固醇含量进行体外定量测定的试剂。依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）、《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管[2013]242号）规定，该产品属于第二类体外诊断试剂产品，分类编码6840。

2.产品命名及检验原理

2.1 产品命名

依据《体外诊断试剂注册管理办法》以及YY/T 1227-2014《临床化学体外诊断试剂（盒）命名》的要求，产品名称规范表述为“总胆固醇测定试剂盒（CHOD-PAP法）”。

2.2 检验原理

标本中的胆固醇酯被胆固醇酯酶（CHER）水解为游离胆固醇，与标本中存在的游离胆固醇被胆固醇氧化酶（CHOD）氧化为胆甾烯酮和过氧化氢，后者再经过氧化物酶（POD）催化，使4-氨基安替比林和酚发生氧化缩合反应，生成红色醌亚胺（称Trinder反应，或称PAP反应）。标本中的胆固醇含量和生成的醌亚胺呈正比，在特定波长检测醌亚胺的吸光度，对照校准物即可计算出标本中的总胆固醇含量。

3.主要性能指标

3.1 试剂空白吸光度

用纯化水或生理盐水等空白样品加入试剂作为样品，在试剂盒规定主波长下测试吸光度值，重复两次，均值即为空白吸光度。双试剂型试剂盒应不大于0.080，单试剂型试剂盒应不大于0.100。

3.2 线性范围

线性范围应至少包含2～10mmol/L，线性相关系数r应不小于0.990。

3.3 准确度

试剂盒测试可用于评价常规方法的国家/国际标准物质3次，测试结果记为（Xi），按公式（1）分别计算相对偏差（B%），如果3次结果都不超过±10%，即判为合格。如果大于等于2次的结果不符合，即判为不合格。如果有1次结果不符合，则应重新连续测试20次，并分别按照公式（1）计算相对偏差，如果大于等于19次测试的结果都不超过±10%，即判为合格。

式中：Xi为测试结果；T为国家/国际标准物质标示值。

注：目前，国家/国际标准物质包括GBW09178、GBW 09179、GBW09180、SRM 909c、SRM 1951c等。

3.4 分析灵敏度

试剂盒测试给定浓度的被测物时，吸光度差值（ΔA）应符合申请人规定的范围。

3.5 精密度

3.5.1批内精密度

重复测试不同浓度（如高、中、低）的质控品或样本10次，CV≤4.0%。

3.5.2批间差

选取3个不同批次的试剂盒，测试不同浓度（如高、中、低）的质控品或样本，每个批号测定3次，试剂盒批间相对极差（R）≤6.0%。

注：应注重医学决定水平（6.2mmol/L）附近样本的选择。

3.6 稳定性

3.6.1效期末稳定性

在规定条件下保存至有效期末进行检验，其结果应符合要求。

3.6.2加速稳定性

根据试剂盒的有效期，将试剂盒放置于37˚C条件下，一定时间（通常是3～7d）后进行检验，其结果应符合要求。

4.产品说明书

说明书承载了产品预期用途、检验方法、检验结果的解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据。以下简要说明说明书的相关要求。

【产品名称】

通用名称：总胆固醇测定试剂盒（CHOD-PAP法）。

【包装规格】

（1）应明确试剂类型，单或双试剂等。

（2）应注明可测试的样本数或装量，如××测试/盒、××mL。

（3）如有货号，可增加货号信息。

【预期用途】

（1）说明试剂盒用于体外定量测定人血清、血浆等样本中总胆固醇的含量。

（2）明确与总胆固醇测定相关的临床适应症背景情况。

【检验原理】

标本中的胆固醇酯被胆固醇酯酶（CHER）水解为游离胆固醇，和标本中存在的游离胆固醇被胆固醇氧化酶（CHOD）氧化为胆甾烯酮和过氧化氢，后者再经过氧化物酶（POD）催化，使4-氨基安替比林和酚发生氧化缩合反应，生成红色醌亚胺（称Trinder反应，或称PAP反应）。标本中的胆固醇含量和生成的醌亚胺呈正比，在特定左右波长检测醌亚胺的吸光度，对照校准物即可计算出标本中的总胆固醇含量，其反应式如下：

【主要组成成分】

（1）说明试剂盒包含组分的名称、比例或浓度。

（2）校准品、质控品应明确其生物学来源，校准品还应明确赋值及溯源性，并写明溯源的最高级别，如量值可溯源至GBW09178、GBW09179、GBW09180或国际参考物质SRM 909c、SRM 1951c。

【储存条件及有效期】

说明试剂盒的效期稳定性、开瓶稳定性（如适用）、复溶稳定性（如适用）等，标明具体的储存条件、生产日期、使用期限或者失效日期。

【适用仪器】

明确适用仪器的具体型号。

【样本要求】

应明确样本类型、处理、保存期限及保存条件等，如涉及血浆样本，应明确抗凝剂的要求。

对已知干扰物进行说明并明确不产生干扰的最高浓度，如：胆红素、血红蛋白、甘油三酯、抗坏血酸。

【检验方法】

详细说明试验操作的各个步骤，包括：

（1）试剂配制方法、注意事项。

（2）试验条件：反应方向、温度、测定主/副波长、样本用量、试剂用量、空白/测定读数时间等。

（3）校准：明确配套使用的校准品及校准方法。

（4）质量控制：明确质控品的使用、质量控制方法、质控频率。

（5）检验结果的计算：应明确检验结果的计算方法。

【参考区间】

明确该产品的参考区间，并简要说明其确定方法。建议注明“由于地理、人种、性别和年龄等差异，建议各实验室建立自己的参考区间”。

【检验结果的解释】

应注明可能需要确认的情况，如检验结果出现与临床不符甚至相悖的情况，应分析查找原因并重新确认等。

【检验方法的局限性】

如试剂盒可稀释，应明确当测定值超出线性上限时的稀释方法以及最大稀释倍数。

注明“本试剂盒的检测结果仅供临床参考，不能作为临床确诊依据，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑等”。

【产品性能指标】

通常包括以下内容：

（1）试剂外观；

（2）空白吸光度；

（3）线性范围；

（4）准确度；

（5）分析灵敏度；

（6）精密度（批内精密度、批间差）。

【注意事项】

通常包括以下内容：

（1）有关人源组分（如有）的警告，如：试剂盒内的质控品、校准品或其他人源组分，虽已经通过了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等项目的检测，但截至目前，没有任何一项检测可以确保绝对安全，故仍应将这些组分作为潜在传染源对待。

（2）对所有样本和反应废弃物都应视为传染源对待。

5.临床评价资料

该项目已经列入《关于发布第三批免于进行临床试验医疗器械目录的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2017年第170号）免于进行临床试验的体外诊断试剂目录中。根据体外诊断试剂临床评价的相关要求，申请人可按照《免于进行临床试验的体外诊断试剂临床评价资料基本要求（试行）》（国家食品药品监督管理总局通告2017年第179号）要求进行临床评价。以下简要说明临床评价的相关要求。

临床评价是指申请人通过对涵盖预期用途及干扰因素的临床样本的评估、综合文献资料等非临床试验的方式对产品临床性能进行评价的过程。

5.1 研究方法

总胆固醇测定试剂盒目前已有相应的参考方法（ALBK法、色谱法等）和境内已上市同类产品，申请人可以选择其中一种方法开展比较研究试验。

5.2 样本要求

评价用样本应来源于人体样本，样本的来源可追溯。评价用样本应涵盖申请注册产品预期用途和含有胆红素、血红蛋白、甘油三酯、抗坏血酸等干扰物质的样本，并应考虑到不同人群之间的差异等。所用样本应能够充分的被用于评价产品临床使用的安全性、有效性。

样本数量应采用合理的统计学方法（如目标值法等）进行计算，并符合统计学要求。可选择总样本量不少于40例并分别采用待评价试剂和对比试剂/参考方法进行双份测定的方式，亦可选择总样本量不少于100例并分别采用待评价试剂和对比试剂/参考方法进行单次测定的方式。其中参考区间以外样本应不少于50%，同时应注重医学决定水平（6.2mmol/L）附近样本的选择，并尽量涵盖检测范围。

评价用的样本类型应与注册申请保持一致。对于具有可比性的不同样本类型，如血清和血浆样本，可在分析性能评估中对样本适用性进行研究，或在临床评价中对每种样本类型分别进行符合统计学意义数量的评估。

5.3 试验操作及周期

申请人可以通过对总样本量不少于40例，用待评价试剂和对比试剂/参考方法进行平行试验，对每份临床样本作双份测定。在试验操作过程中应对样本进行编盲，试验检测周期至少为5d。

申请人也可以通过对总样本量不少于100例，用待评价试剂和对比试剂/参考方法进行平行试验，作单次测定。在试验操作过程中应对样本进行编盲，试验检测周期至少为5d。

5.4 数据收集和处理

应首先进行离群值观察，离群值的个数不得超过限值。若未超限，可删除离群值后进行分析；若超出限值，则需合理分析原因并考虑纠正措施，必要时重新收集样本进行分析。离群值分析和处理方法应有依据。

5.5 统计学分析

对试验结果的统计应选择合适的统计方法，如相关分析、线性回归、偏倚/偏差分析等。对于对比试验的等效性研究，最常用是对待评试剂和对比试剂/参考方法两组检测结果的相关及线性回归分析，应重点观察相关系数（r值）或判定系数（R2）、回归拟合方程（斜率和y轴截距）等指标。

6.小结

本文所述内容是在现行法规、标准体系的认知，旨在期望能够为注册申请人准备总胆固醇测定试剂盒（CHOD-PAP法）注册申报资料时提供参考。

[1] 中国成人血脂异常防治指南修订联合委员会.中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)[J].中国循环杂志,2016,31(10):937-953.

[2] 尚红,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程(第4版)[M].北京:人民卫生出版社,2015.

[3] U.S. Food & Drug Administrion. Guidance for 510(k)s on Cholesterol Tests for Clinical Laboratory, Physicians' Oきce Laboratory and Home Use[S].1995-07-13.https://www.fda.gov/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm094140.htm.