氰基丙烯酸酯医用胶的细胞毒性实验影响因素

张涛 张伟 王红平 徐亮 ＊

1 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点试验室 （北京 100850）

2 四川省食品药品检验检测院 （四川 成都 611731）

医疗器械注册申报中，细胞毒性试验是重要检测指标，国内参考标准主要是GB/T16886.5-2003和GB/T14233.2-2005。由于标准中规定的是共性试验方案，针对具体品种，开展方法学研究，考察相关影响因素以确定符合产品特质的最适合条件，是产品研发必要环节。

氰基丙烯酸酯医用胶在临床上广泛用于伤口粘接、止血等目的。目前有数个产品上市（如多抹棒、康派特），同时，多项研究也报道了相关结构设计和性能优化等工作，但不同工作中获得的细胞毒性结果差异性较大[1-6]。除单体结构差别外，不同的试验方法可能是一个重要原因。因此，对氰基丙烯酸酯医用胶的细胞毒性试验进行方法学研究，探讨相关影响因素，有助于建立相对统一的认识。此外，探讨细胞毒性试验共性的影响因素，对于更广范围的医疗器械评价也具有参考意义。

本文以氰基丙烯酸正丁酯（504）为例，考察细胞种板数目、浸提介质、浸提条件、细胞与浸提液的培养时间、细胞活性检测方法等因素对评价结果的影响，并以此优选具体试验方法。

1.材料与方法

1.1 一般材料

材料：选用本实验室合成的504；对照材料：阳性对照为含体积分数0.5%DMSO的生理盐水溶液；阴性对照为DMEM（含体积分数10%FBS）细胞培养液。

试剂：DMEM培养基、PBS、青霉素，购自Gibco；二甲基亚砜（DMSO）、胎牛血清（FBS）、四甲基偶氮唑盐（MTT），购自Sigma；0.9%生理盐水（石家庄四药有限公司），0.25%胰蛋白酶(EDTA，Amresco），Cell Counting kit-8试剂盒（CCK-8，博士德生物工程有限公司）。

细胞株：采用GB/T16886.5-2003标准中推荐的传代2d、生长旺盛的小鼠成纤维细胞L929，由中国医学科学院细胞资源中心提供。

1.2 方法

材料浸提液制备：以0.9%生理盐水或DMEM为浸提介质，质量/体积比为0.1g/mL，在37˚C、含体积分数5%CO2细胞恒温培养箱中浸提24h或72h，得到的浸提液于24h内进行试验。

细胞毒性试验及细胞形态学观察：将生长旺盛的L929细胞接种于48孔培养板中并放置于37˚C、5%CO2恒温培养箱中24h；加入200μL浸提液，置于培养箱中培养一定时间，观察细胞生长状态并采用MTT或者CCK-8方法检测细胞相对增殖率。每个样品重复3次实验。

2.结果

2.1 细胞种板条件

为了在统一条件下进行比较，选用48孔培养板，选取传代48～72h生长旺盛的L929细胞进行种板，细胞数设为1×104个/孔、5×104个/孔、8×104个/孔、1×105个/孔。培养24h后，种板数目为1×104个/孔细胞密度稍显稀疏，1×105个/孔则稍显致密，但四个条件下L929细胞均呈长梭形的正常形态，贴壁生长良好，无细胞溶解现象，说明细胞生长情况良好，均适合开展进一步的细胞毒性评价试验。

2.2 细胞种板数目对细胞毒性试验结果的影响

国标GB/T16886.5-2003中未对细胞种板数量进行规定，但这一因素可能对细胞毒性试验结果产生重要影响。按照2.1中种板数量进行分组测试，其他试验条件为：以0.9%生理盐水为浸提介质，浸提条件为37˚C、24h。为保持良好的细胞培养液条件，将浸提原液以DMEM进行梯度稀释后（分为50%组，25%组），再进行细胞培养24h，以MTT法检测细胞活性。结果如表1所示。

随着细胞种板数目增大，各组中细胞相对增殖率逐渐升高。在显微镜下可观察到，细胞种板数目8×104个/孔、1×105个/孔的细胞形态正常、贴壁生长良好、细胞溶解现象较少，而1×104个/孔出现细胞层破坏、呈圆形结构、疏松贴壁、部分细胞溶解的现象。这一结果说明，细胞种板数目是细胞毒性试验的重要影响因素。此外，试验中也观察到，随着浸提液的梯度稀释，细胞相对增殖率逐渐提高。

2.3 不同浸提介质对细胞毒性试验结果的影响

国标GB/T16886.5-2003中对材料浸提介质的要求是“可使用含血清培养基、不含血清培养基、生理盐水溶液以及其他适宜的溶剂作为浸提介质”。分别选择生理盐水、生理盐水+10%FBS、DMEM为浸提介质，其他试验条件为：细胞种板数目为1×105个/孔，浸提时间为24h，以MTT为细胞活性检测方法。结果如表2所示。

结果显示，生理盐组细胞增殖率高于生理盐水+10%FBS组和DMEM组，说明浸提介质是体外细胞毒性试验的重要影响因素。DMEM组增殖率较低可能是由于培养基中含有各种氨基酸和葡萄糖等成分，与聚氰基丙烯酸酯材料在溶液条件下发生相互作用，加速材料降解，从而导致单位时间产生更多副产物如甲醛等。

2.4 不同浸提时间对细胞毒性试验结果的影响

国标GB/T16886.5-2003中对浸提时间的要求是“（37±2）˚C下不少于24h、（50±2）˚C下（72±2）h”。分别选择37˚C条件下24h或者72h，其他条件为：细胞种板数目为1×105个/孔，以生理盐水为浸提介质，以MTT为细胞活性检测方法。结果如表3所示。

在50%浸提稀释液条件下，浸提24h组的细胞毒性明显低于浸提72h组，说明浸提时间是细胞毒性试验的重要影响因素。这可能是由于聚合物会逐渐降解，在较小体积的浸提液条件下，降解产物逐渐累积，尤其是在50%组中，浸提液的降解产物累积达到对细胞毒性的影响较为显著的程度。

表1. 不同细胞数目条件下细胞相对增殖率(x±s)

表2. 不同浸提介质条件下细胞相对增殖率(x±s)

表3. 不同浸提时间条件下细胞相对增殖率(x±s)

表4. 不同培养时间条件下细胞相对增殖率(x±s)

2.5 细胞在浸提液中不同培养时间对细胞毒性结果的影响

国标GB/T16886.5-2003要求“浸提液及其浸提稀释液与细胞培养时间不低于24h”。为了考察细胞与浸提液培养时间对于细胞毒性试验结果的影响，分别设置培养时间为24h或者72h。其他条件为：细胞种板数目为1×105个/孔，以生理盐水为浸提介质，浸提时间为24h，以MTT为细胞活性检测方法。试验结果如表4所示。

结果显示，在各个浸提液浓度梯度条件下，培养24h组的细胞毒性都要低于培养72h组，这说明细胞与浸提液培养时间是细胞毒性试验结果的重要影响因素，相关原因可能与2.4中的情况类似，聚合物的降解片段在细胞培养的时间段内进一步降解，并且在较小的体积中持续对细胞造成毒性。2.6不同检测方法对细胞毒性试验结果的影响

分别采用MTT和CCK-8试剂盒检测细胞活性，其他条件为：细胞种板数目为1×105个/孔，以生理盐水为浸提介质，浸提时间为24h，浸提稀释液加入细胞孔板后培养24h。试验结果如表5所示。

结果显示，MTT和CCK-8检测方法得到的细胞毒性试验结果存在一定差异，除50%组外，其他两组CCK-8数值高于MTT。

3.讨论

本文考察了影响氰基丙烯酸酯医用胶细胞毒性试验的因素。结果显示，细胞种板数目、浸提介质、浸提时间、浸提液与细胞培养时间以及检测方法都是重要影响因素。根据GB/T16886.5-2003要求及规定范围，医用胶的细胞毒性试验方法可以设置为：将聚合物材料置于37˚C、5%CO2培养箱中、以0.9%生理盐水浸提24h（材料质量与浸提介质体积比0.1g/mL），将L929细胞（48孔板，1×105个/孔）置于浸提液及其稀释液中培养24h，采用MTT方法检测细胞相对增殖率。

表5. 不同细胞活性检测方法细胞相对增殖率(x±s)

此外，为了使细胞增殖率差异更为明显，采用了较大的浸提比例，即，按照质量/体积比0.1g/mL的方法制备浸提液。但考虑到医用胶实际使用后呈高分子膜，按照GB/T 16886.12-2005中要求，还可选择表面积/体积计算的浸提方法，例如厚度小于0.5mm的情况下浸提比例可为6cm2/mL，换算为质量/体积比的值会远小于本文采用的浸提方案。因此，选择合理的浸提比例方法也将是重要的影响因素。

需要指出的是，体外细胞毒性试验条件与体内实际情况存在差别：材料在液态浸提介质中的降解速率有别于在人体组织中的降解；孔板中固定量浸提液也有别于体内环境下的体液流动性和可交换性；在孔板中会累积降解产物，而体内条件下如果降解产物本身有良好的可代谢性，就能够快速排出体外而不会因浓度蓄积在局部造成严重结果。因此，对体外细胞毒性试验的结果判定中，尤其是诸如可降解生物材料浸提条件选择时，应该谨慎对待。可结合动物模型和组织病理学相关分析来进行全面的毒性判定。再者，试验细胞的来源和状态可能也对结果有重要影响。

本文探讨的这些影响因素在细胞毒性试验中同样具有一定共通性，对于更广泛的医疗器械评价也具有实际参考意义。

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