免疫与感染细粒棘球绦虫对Beagle犬血液生理生化指标的影响

王俊伟,张壮志,赵 莉,石保新*,韩 涛,叁都哈西,陈世军,张文宝

(1.新疆畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐 830011; 2.新疆医科大学第一附属医院医学研究中心,新疆包虫病基础医学重点实验室,新疆乌鲁木齐 830054)

棘球蚴病俗称包虫病，是主要由细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus,Eg)幼虫引起的重要的人畜共患寄生虫病。犬是Eg 最主要的终末宿主，在包虫病的传播中起到关键的作用，是棘球蚴病的主要传染源。研究证实，细粒棘球绦虫成虫基因中的EgM基因家族与虫卵发育和形成数量以及虫体发育相关。其中，表达的EgM9和EgM123蛋白经免疫保护试验证实都具有良好的抗细粒棘球绦虫感染的保护效果[1]。而用Eg原头蚴(PSCs)人工感染犬，30 d～35 d后，用氢溴酸槟榔碱下泻，再用吡喹酮和阿苯达唑联用彻底驱虫，经过4个～6个感染和治疗循环获得抗虫保护犬，且犬血清可以识别原头蚴抗原[2-4]。Beagle犬作为一种通用型标准实验犬，广受国际科研工作者欢迎，性情温顺，灌服和采血方便，测得的实验数据，结果重复性好[5-6]。本文对EgM蛋白3次免疫后和PSCs 5次重复感染后的Beagle犬的生理生化指标进行了测定与比较分析，初步探索免疫及感染/治疗循环是否会影响封闭饲养群Beagle犬的血液生理生化指标，旨在为犬包虫病疫苗的研制积累临床数据资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选择具有实验动物许可的单位(常州贝乐实验动物养殖有限公司，生产许可证号：SCXK(苏)2013-0006)提供的10月龄～12月龄、体重基本一致的健康Beagle犬50只，严格按照实验动物饲养管理标准饲养。随机分为4组，每组都公母各半，具体分组如下：10只为对照组，20只为免疫组，20只为反复感染组。

1.1.2 血样来源 三免后1周或者经过感染-下泻-驱虫如此4个循环后，感染第5次PSCs后1周，Beagle犬空腹12 h，使用一次性真空贮血管肝钠素抗凝管和普通管经前肢静脉各采血8 mL。

1.1.3 试剂及仪器 Mindray BC-2800Vel血球计数仪配套的专用检测试剂。 离心机，移液器，Mindray BC-2800Vel血球计数仪，Mindray BS-180全自动生化分析仪。

1.2 方法

1.2.1 免疫与灌服 对照组不做任何处理。

免疫组分为EgM9蛋白免疫组和EgM123蛋白免疫组，10只/组。将含EgM9或EgM123和QuilA各100 μg的免疫混合物，犬颈部皮下注射，1 mL/(只·次)，免疫3次。

反复感染组做如下处理：将新鲜收集的PSCs人工灌服感染犬，20万枚/(只·次)，35 d后，用氢溴酸槟榔碱下泻，然后吡喹酮和阿苯达唑联用彻底驱虫。经过4个如此感染和治疗循环及第5次感染。

1.2.2 血液生理生化指标测定 用Mindray BC-2800Vel血球计数仪检测所采集抗凝血的生理指标；普通管所采血液于室温离心，分离血清，用Mindray BS-180全自动生化分析仪测定生化指标。按照相关标准和仪器操作说明进行。

2 结果

2.1 组间Beagle犬血液生理值比较

通过方差分析及t检验分析发现，各免疫组受到来自免疫外源蛋白和佐剂的相同3周时间的刺激，都未引起各组间Beagle犬的各项生理指标出现显著性差异(P>0.05)；与感染组相比，仅EgM9组的PCT显著增高(P<0.05)。感染组经过5次PSCs的重复感染的刺激，与对照组相比Beagle犬的各项生理指标基本未出现显著性差异(P>0.05)，仅Eos%显著低于对照组(P<0.05)(表1)。

2.2 组间Beagle犬血液生化值比较

通过方差分析及t检验分析发现，各免疫组受到来自免疫外源蛋白和佐剂的相同3周时间的刺激，都未引起各组间Beagle犬的各项生化指标出现显著性差异；与感染组相比，EgM9组的ALP显著增高(P<0.05)。感染组经过5次PSCs的重复感染的刺激，CREA显著高于对照组、免疫组(P<0.05)，GLU高于EgM123组(P<0.05)，ALP和P都显著低于对照组(P<0.05)(表2)。但值得注意的是，对照组和免疫组的DBil-D指标以及感染组的GGT指标，由于其中某几个样本值的偏高，导致所得方差大于平均值，差异不显著(P>0.05)。

表1 Beagle犬血液生理指标

注：a和b之间、c和d之间有显著性差异(P<0.05)。

Note:There are significant differences between a and b,c and d.

3 讨论

血液是动物体内循环系统的重要组成部分，除行使运输功能为身体各个细胞输送养分带走代谢废物外，对机体还具有体内防御、免疫、体液调节以及维持内环境稳定的作用。血液的生理生化指标是动物健康及遗传稳定的衡量标准与指标，对科学研究具有重要的参考价值，也可作为临床疾病诊断的重要依据。国外关于这方面的研究相对较多，国内较之则系统数据较少。研究证实，Beagle犬各项血液生理生化指标可能受诸多因素影响而产生变化[6-15]。7～8月龄Beagle犬的血液生理指标相对稳定，只有某些生化指标会受性别及月龄的影响而出现显著差异[8]，种犬的RBC、HB、PLT等3个血液生理指标明显高于幼犬，说明不同的生长周期可影响Beagle犬血液学指标[9]；而且此种犬的某些血液学和血液生化指标在1 d内不同时间或饲喂前后均发生明显波动[10]，存储方式、存放时间、运输应激炎症以及一些药物等也都会影响血液学指标[6,13-15]。

表2 Beagle犬血液生化指标

注：a与b、c、d之间有显著性差异(P<0.05)。

Note:There are significant differences between a and b,c and d.

通过给Beagle犬免疫外源表达的细粒棘球绦虫EgM家族的2个蛋白(EgM9和EgM123)以及人工感染PSCs和药物驱虫治疗如此循环，初步探索分析了它们会对Beagle犬血液生理生化指标造成的影响。从试验结果可见，无论是生理指标，还是生化指标，虽然数据有所波动，但范围并不大，基本在参考范围内；较少部分指标发生上升，比如AST、DBil-D、CREA等，CREA的上升可能暗示犬饲养过程中存在饮水不足，应注意这个问题；个别指标下降。从总体而言，各组间大部分指标未发现显著差异。给我们启示，定期采血检查，及时发现饲养中可能存在的问题及分析造成问题的因素，可能从侧面印证了Beagle犬在封闭饲养环境下已经形成了生长期血液生理生化指标具有相对稳定性的特征。初步试验结果显示Beagle犬的生理生化指标并未因免疫蛋白的注射产生影响，基本保持在正常范围之内，没有显著差异，且肉眼观察实验犬的外观、进食、排泄等无异常，暗示免疫的EgM9/123蛋白作为候选疫苗是相对安全的。而Beagle犬多次经过细粒棘球绦虫原头蚴的感染以及药物治疗的循环，获得抗虫性，可产生很好的保护效应，一方面是以血清抗体上升和细胞因子的相应变化来呈现，另一方面是从随着感染/治疗的循环的不断进行下泻虫体计数基本呈越来越少的趋势来体现；但在血液生理生化指标上并未产生明显的影响，仅指标ALP、CREA、P和Eos%出现显著差异，间接表明所用驱虫药物未对实验犬造成明显的影响，是安全的。但当把PSCs看作不加佐剂的活抗原“疫苗”，通过人工灌服“免疫”实验犬，结果则表明与EgM蛋白组相比，生化指标ALP、CREA和GLU出现显著差异。结果表明，EgM蛋白作为候选疫苗是安全的；不管是EgM蛋白免疫，还是PSCs感染和药物治疗的循环，都没有对实验犬的血液生理生化指标产生明显的影响，它们之间并没有表现出确切的统计学关联性，可能还需要更加深入的研究，也提示驱虫药物的反复服用也没有表现出明显的毒副作用。

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