猪蛔虫个体内ITS1序列差异比较

石琴华，王涵琪，周 唯，吴小平，牛红艳，周春花

(南昌大学生命科学学院，江西南昌 330031)

猪蛔虫(Ascarissuum)隶属于线虫纲、蛔虫目蛔科，是寄生于猪小肠的大型寄生线虫，它广泛流行，呈世界性分布,集约化饲养的猪和散养猪均广泛感染[1]。猪蛔虫给养猪业带来了很大的危害，一是感染普遍，二是严重影响仔猪生长发育[2]。据调查报道，我国猪群感染猪蛔虫的感染率为17%～80%，这给我国养猪业带来了巨大的损失[1]。猪蛔虫病对育肥猪的影响很大，当育肥猪感染蛔虫后，它们的生长速度会下降，对饲料的利用率也会降低，随之体重比正常育肥猪低，育肥期延长，更甚者会导致猪发育停滞，甚至死亡[3]。

内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)不加入成熟核糖体，受到的选择压力较小，进化速率较快，在核苷酸序列及长度上存在变异性[4]，因此ITS1被广泛应用于蛔虫基因型鉴定[5-6]。早期，Zhu X等[6]首次对不同国家的人蛔虫与猪蛔虫种群的ITS核苷酸序列进行了比较，发现ITS1基因序列存在6个核苷酸差异，并用这些差异来区分人蛔虫和猪蛔虫；Peng W D等[5]用SSCP(单链构象多态性)鉴定出中国人蛔虫ITS1片段有5种基因型(即G1、G2、G3、G4和G5)，中国猪蛔虫有3种(G1、G2和G3)，人蛔虫种群主要以G1为主，而猪蛔虫主要以G3为主。Leles D等[7]基于ITS1基因分子标记对巴西人蛔虫的研究中发现了一种新的基因型(G6)；随后，他对来自巴西两个不同地区的人蛔虫个体内ITS1序列差异进行了分析，克隆测序发现一个样本中存在2～4个单倍型，且检测到了13个新的单倍型，于是提出ITS1基因对于用来鉴别人蛔虫的基因型应该重新考虑[8]。之后，Das K等[9]对印度人蛔虫种群的遗传模式和遗传多样性进行了探讨，结果鉴定出试验的大部分人蛔虫样本的ITS1序列属于基因型G1，并发现了8个新的ITS1序列。Sparks A M等[10]通过PCR-RFLP方法对厄瓜多尔和桑给巴尔的蛔虫的ITS区域进行了分析，在采自桑给巴尔人体内的一个蛔虫样本中发现了猪蛔虫的ITS基因型，作者解释这可能是历史遗留的特征；Jesudoss C J等[11]对美国爱尔华地区猪感染的蛔虫进行了研究，通过PCR-RFLP方法对ITS的基因型进行分析，结果发现在这些样本中存在人型和杂交型蛔虫。对于人蛔虫与猪蛔虫的分类地位一直存在着争议，不少的研究学者利用不同的分子标记对其进行了探讨[12-13]，近年来的研究表明新一代的测序可以提供多个基因组序列，如旋毛虫[14]和血吸虫[15]，类似的方法可以应用于世界各地同域地区隔离的蛔虫，这为蛔虫种群的比较基因组研究开辟了新的路径，从而为蛔虫的传播和进化提供了前所未有的见解，同时也对其是否为一个种提供了更明确的结论[13]。本研究的目的是通过分析猪蛔虫ITS1个体内序列差异，评估该区域作为分子标记鉴定人蛔虫和猪蛔虫差异、基因分型方面的价值，同时对猪蛔虫的防控具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本采集 猪蛔虫采自江西省新建县的屠宰场的猪体内，获取的成虫用生理盐水洗干净后，置于-80℃冰箱中保存。

1.1.2 主要试剂 蛋白酶K、dNTP、TaKaRa 10×buffer、MgCl2、Taq酶，购自南昌天沃科技有限公司；Wizard®SV Genomic DNA Purification System，Promega公司产品；EZ-10 spin column PCR product purification kit，上海生工生物工程有限公司产品；PMD18-T载体、DH5α感受态细胞，TaKaRa公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 取成虫样本体壁组织50 mg，将其置于2 mL离心管中剪碎，用蛋白酶K消化过夜，使用Promega公司的试剂盒(Wizard®SV Genomic DNA Purification System)提取基因组DNA。

1.2.2 ITS1扩增及分子克隆 采用朱兴全[6]等报道的引物NC5和NC13R扩增ITS1。正向引物NC5为5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′，反向引物NC13R为：5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT-3′，引物是由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系为100 μL：12 μL MgCl2，10 μL TaKaRa 10×buffer，10 μL的dNTP(2.5 mmol/L)，1 μLTaq酶，引物各5 μL(10 μmol/L)，模板3.3 μL，加双蒸水至100 μL。反应程序：94℃ 5 min；接着进行30个循环：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s；最后72℃延伸5 min。使用试剂盒(EZ-10 spin column PCR product purification kit)对PCR产物进行纯化，纯化后进行酶连，将目的片段连接到PMD18-T载体上，随后将酶连产物转入DH5α感受态细胞进行转化，挑选单个白色菌落进行扩大培养，再PCR扩增菌落，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物，最后将菌落PCR产物(每个样本选取3个菌液)为阳性的菌液送往上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.3 序列比对 通过MEGA5.0将获得的序列与GenBank中下载的序列进行比对，找出猪蛔虫个体内ITS1序列差异。

2 结果

扩增ITS1基因获得约500 bp的片段(图1)，PCR产物经纯化、酶连、转化培养后，通过琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物(图2)，获得15个克隆子。测序共得到7个不同的ITS1基因序列。通过MEGA5.0将经过分子克隆的测序结果与GenBank中的序列(G1-G6)进行对比，有2个ITS1基因序列与之前研究过的2种基因型(G2和G3)相同，除此之外还检测到5种新的单倍型(命名为HC1-HC5)(表1)。在所测样本中，有2个样本(ZC2和ZC5)检测到3种基因型或单倍型，有1个样本(ZC1)检测到2种基因型或单倍型，没有样本检测到G1、G4、G5、G6基因型(表2)，G3基因型存在大多数的样本中。检测到的新的单倍型和GenBank中已有的基因型或单倍型部分多态位点见表2。

M.DNA标准DL 1 000；1～5.样本；6.阴性对照

M.DNA Marker DL 1 000; 1-5.Samples; 6.Negative control

图1 ITS1基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of ITS1 gene PCR products

M.DNA标准DL 2 000；1～9.菌落PCR产物；10.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-9.Colony PCR products; 10.Negative control

图2 菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

表2 中国与全球各地蛔虫ITS1的基因型/单倍型的部分多态性位点

注：H.人；P.猪；Al：A.lumbricoides,As.A.suum；Ba.孟加拉国；Br.巴西；Ch.中国；Au.澳大利亚；UK.英国；De.丹麦；S.核苷酸G或C；-.核苷酸缺失；· .与G1型相同；▼在这篇论文中。

Note:H.human;P.pig;Al:A.lumbricoides(without nomenclature),As.A.suum(without nomenclature);Ba.Bangladesh;Br.Brazil;Ch.China;Au.Australia;UK.United Kingdom;De.Denmark;S.Nucleotide G or C;-.nucleotide deletion,dots:similar to reference sequence G1;▼.In this paper.

3 讨论

由于内转录间隔区属于非编码区且有多个拷贝(在蛔虫中有42个拷贝[16])，所以在单个蛔虫个体内ITS1序列可能存在差异。本研究检测到了这种差异，即同一猪蛔虫样本的ITS1序列中存在多种基因型或单倍型。Peng W D等[5]检测到的G2、G4和G5基因型包含可变位点，认为这些可变位点是由不同基因型蛔虫个体之间杂交造成的。而我们认为这实际上是两种不同的ITS基因型特征在同一个体内的表现。从表2中可以看到，同一个体的ITS1序列拷贝并不完全一致，总是会有个别的碱基差异，在polyA和polyT之间尤为明显，造成这种现象的原因，除了测序的因素以外，我们认为还有一个很重要的因素，即ITS1个体内差异。由以前的文献得知，即使是同一个体也可能含有多种ITS1序列[17]，仅仅是数量不同而已，碱基A和碱基T之间只有2个氢键相连，所以更加容易发生变异。这也与Leles D等[8]得到的结论相符。总之，将ITS1序列作为鉴别猪蛔虫基因型的标准应该重新加以考虑。

参考文献：

[1] 李洪宇.猪蛔虫病的流行、诊断与综合防控[J].现代畜牧科技,2015(6):115-115.

[2] 范昌顺.猪蛔虫病的诊断和治疗[J].中国畜牧兽医文摘,2016,32(8):184-184.

[3] 孙文库.肥育猪场发生猪蛔虫病的危害及防治措施[J].国外畜牧学-猪与禽,2017,37(5):76-77.

[4] 罗 琴,谭立娉,胡 伟,等.野生动物捻转血矛线虫的分子鉴定及PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学,2015(1):80-84.

[5] Peng W D,Yuan K,Zhou X M,et al.Molecular epidemiological investigation ofAscaris,genotypes in China based on single-strand conformation polymorphism analysis of ribosomal DNA[J].Electrophoresis,2003,24(14):2308-2315.

[6] Zhu X,Chilton N B,Jacobs D E,et al.Characterisation ofAscarisfrom human and pig hosts by nuclear ribosomal DNA sequences[J].Int J Parasitol,1999,29(3):469-478.

[7] Leles D,Araújo A,Vicente A C P,et al.Molecular diagnosis of ascariasis from human feces and description of a newAscarissp.genotype in Brazil[J].Vet Parasitol,2009,163(1-2):167-170.

[8] Leles D,Araújo A,Vicente A C P,et al.ITS1 intra-individual variability ofAscarisisolates from Brazil[J].Parasitol Int,2010,59(1):93-96.

[9] Das K,Chowdhury P,Ganguly S.Internal transcribed spacer 1 (ITS1) based sequence typing reveals phylogenetically distinctAscarispopulation[J].Comput & Struct Biotechnol J,2015,13:478-483.

[10] Sparks A M,Betson M,Oviedo G,et al.Characterization ofAscarisfrom Ecuador and Zanzibar[J].J Helminthol,2015,89(4):512-515.

[11] Jesudoss Chelladurai J,Murphy K,Snobl T,et al.Molecular epidemiology ofAscarisinfection among pigs in Iowa[J].J Infect Dis,2017,215(1):131-138.

[12] Betson M,Stothard J R.AscarislumbricoidesorAscarissuum:what's in a name[J].J Infect Dis,2016,213(8):1355-1356.

[13] Kapel C M,Nejsum P.Ascarisfrom humans and pigs appear to be reproductively isolated species[J].Plos Negl Trop Dis,2016,10(9).

[14] Korhonen P K,Pozio E,La R G,et al.Phylogenomic and biogeographic reconstruction of theTrichinellacomplex[J].Nat Commun,2016,7(2):10513.

[15] Crellen T,Allan F,David S,et al.Whole genome resequencing of the human parasiteSchistosomamansonireveals population history and effects of selection[J].Sci Rep,2016,6:20954.

[16] Pecson B M,Barrios J A,Johnson D R,et al.A real-time PCR method for quantifying viable ascaris eggs using the first internally transcribed spacer region of ribosomal DNA[J].Appl & Environ Microbiol,2006,72(12):7864-7872.

[17] 牛庆丽,罗建勋,殷 宏.转录间隔区(ITS)在寄生虫分子生物学分类中的应用及其进展[J].中国动物传染病学报,2008,16(4):41-47.