一株戊糖片球菌对发酵羊肉干品质的影响

张开屏，张保军，田建军，*

（1.内蒙古商贸职业学院食品工程系，内蒙古呼和浩特010070；2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018）

羊肉干是在油炸、微波、高温等条件下制作而成一种水分含量较低、货架期较长、具有特殊肉香味的干肉制品，通过微生物发酵可改善肉干质地、色泽及风味，是消费者最为喜爱的一种肉干产品[1-2]。肉干干燥方式包括自然干燥和热风干燥，自然干燥主要被用于牧户自制肉干，而热风干燥主要被用于工业化生产。因热风干燥过程温度控制较为自动化，从而降低制作成本，但产品干燥速率表现为内慢外快，致使肉干表面结痂较为严重，同时易引起内部酶变，常需添加嫩化剂进行嫩化处理达到改善肉干质地和品质的目的[3-5]。国外学者通过改进羊肉干干燥方式达到改善羊肉干物性特性的目的，Shi等[6]研究表明，利用红外-热风组合（combination of Infrared-hot air，CMIHA）干燥方法处理后蓝莓质构特性好于经热风干燥后样品的品质。为了改善经热风干燥而造成羊肉干过度硬化，目前国内已采用多种嫩化方法，如滚揉、添加外源蛋白酶、添加CaCl2嫩化剂等[7-8]。添加外源酶嫩化处理主要原理：外源酶在适宜温度和一定时间内分解肌肉中肌原纤维蛋白及胶原蛋白起到嫩化作用。本试验主要通过添加外源木瓜蛋白酶及具有较强抗氧化、清除自由基等特性的戊糖片球菌制作发酵羊肉干，以自然发酵为对照，探究木瓜蛋白酶、戊糖片球菌及其复配对羊肉干品质特性的影响，旨在为发酵羊肉干的工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与主要设备

羊后腿肉（去肥膘及筋膜）、食盐、绵白糖、黑胡椒粉、生姜、洋葱、生抽：市售；谷氨酸钠、亚硝酸盐（均为食品级）：呼和浩特美通市场；戊糖片球菌（内蒙古传统风干肉中分离）：内蒙古农业大学肉品科学与技术团队提供；木瓜蛋白酶（80万U/g）：江苏宝莱生物科技有限公司。

TA.XT Express质构仪：英国Stable Micro System公司；TCP色差仪：北京奥依克光电仪器公司；SIGMA 3-18K高速台式冷冻型离心机、BSA223S-CW电子精密天平：德国Sartorius公司；KDY-9830凯氏定氮仪：北京瑞邦兴业科技有限公司；PB-10 pH计：德国Sartorius公司；Lab Master-Aw控温台式水活度测定仪：瑞士Novasina公司。

1.2 工艺配方

1.2.1 配方

食盐 5 g/kg；发酵剂 107CFU/g；白砂糖 0.5%；葡萄糖0.1%；黑胡椒粉0.5%；生姜0.5%；洋葱0.5%；生抽5 mL/kg；亚硝酸盐70 mg/kg；硝酸盐100 mg/kg。

1.2.2 工艺

发酵羊肉干工艺条件见表1。

表1 发酵羊肉干工艺条件Table 1 The process conditions of fermented dry mutton

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计

本试验按照发酵肉制品筛选要求，选用一株具有较强产酸能力、抗氧化、清除自由基能力的戊糖片球菌；并且通过木瓜蛋白酶与戊糖片球菌配比试验，获得发酵剂与木瓜蛋白酶最佳添加量分别为107CFU/g和2.4×106U/kg。以不加发酵剂为对照组；只加木瓜蛋白酶，为木瓜蛋白酶组；只加戊糖片球菌，为单一组；木瓜蛋白酶与戊糖片球菌为复配组。样品分别将原料肉及腌制结束（0.5 d）、发酵结束（2 d）、干燥中期（4 d）、成熟（7 d）等工艺点样品随机抽取，并测定如下理化品质。

1.3.2 菌株特性测定

1.3.2.1 完整细胞和无细胞提取物的制备

将筛选好的菌株在MRS液体培养基中连续传代3次后离心（6500 r/min，7 min），用双蒸水洗涤3次菌体沉淀后，调整菌悬液浓度为109CFU/mL。将菌悬液分为两组，一组为完整细胞组，另一组采用超声波冰浴破碎（功率为400 W，处理5 s、间隔5 s，持续10 min）后，经12000 r/min离心15 min，取上清液即为胞内提取物组。

1.3.2.2 清除DPPH自由基能力的测定

参考Van等[9]方法：取待测液和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）无水乙醇溶液（0.2 mmol/L）各1 mL，混匀后避光反应后30 min 离心（6500 r/min，10 min），测定上清液的OD517。

式中：A1为1 mL的DPPH溶液+1mL样品的OD值；A2为1 mL无水乙醇+1 mL样品的OD值；A0为1 mL DPPH溶液+1 mL无水乙醇的OD值。

1.3.2.3 清除羟自由基能力的测定

参照Wu等方法[10]的，在灭菌试管中加入水杨酸-乙醇溶液（5 mmol/L）、FeSO4溶液（5 mmol/L）和 H2O2溶液（3 mmol/L）各 1 mL 混匀后加入不同体积（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL）的待测液，以及与待测液相同体积的VC（1 mmol/L），37 ℃水浴 15 min 后离心（6500 r/min，10 min），测定 OD510。

式中：A1为加入待测溶液后的OD值；A0为用蒸馏水代替样品溶液的OD值。

1.3.2.4 抗脂质过氧化能力测定

首先将PBS（pH值7.4）与等体积蛋黄混合为1∶25（体积比）的蛋黄悬液。分别取1 mL蛋黄悬液、PBS、FeSO4（25 mmol/L）与 0.5 mL 菌悬液混匀，37 ℃振荡30 min，然后加入1 mL 20%三氯乙酸，静置10 min后3500 r/min离心10 min，取3 mL上清液与2 mL TBARS（0.8%）混匀，沸水浴中反应 10 min，冷却后在532 nm波长处测其吸光值[11]。

式中：A1为样品溶液的OD值；A0为用PBS代替样品溶液的OD值。

1.3.3 理化品质的测定

参照GB/T9695.5-2008《肉与肉制品pH测定》测定香肠pH值[12]；参照硫代巴比妥酸法（thiobarbital acid，TBA）测定羊肉干中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量[13]；使用HD-3A型智能水分活度仪测定Aw。

成品率：从原料肉开始，每一阶段结束测定羊肉干的重量，直到发酵羊肉干成熟。计算公式：X=M/M0，式中：M0为指起始羊肉干质量，g；M为指原料、腌制、发酵、干燥、成熟结束等阶段羊肉干质量，g。

1.3.4 羊肉干质构的测定

利用质构仪测量的是发酵羊肉干质构（TPA）参数。TPA试验同样将成熟后的发酵羊肉干切为1 cm×1 cm×1 cm（长×宽×高）的立方体，探头选择为 P35，测前速度为2 mm/s，测中速度为10 mm/s，测后速度为10 mm/s，目标模式为压缩模式（compression），应变值选择40%，时间选为5 s，触发模式为自动，触发力选择5.0 g。通过TPA试验可以获得的参数有硬度、咀嚼性、弹性、内聚性、回复性。

1.4 数据处理

采用Excel和Spss19.0对数据进行统计处理和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 发酵剂菌株特性研究

通过测定菌株抑制率、羟自由基及DPPH自由基清除率等指标，探究发酵特性如图1。

图1 戊糖片球菌抗氧化能力研究Fig.1 Study on the antioxidant capacity of P.pentosaceus

图1比较了戊糖片球菌的完整细胞及胞内提取物的脂质过氧化抑制率、清除DPPH自由基及清除羟自由基能力大小。试验表明戊糖片球菌抗脂肪氧化及清除羟自由基、DPPH自由基的能力均高于胞内提取物；且两者抗脂肪氧化、DPPH自由基清除率差异极显著（P＜0.001）；说明将戊糖片球菌完整细胞应用于发酵肉干有助于提高羊肉干品质及抑制脂质过度氧化。

2.2 发酵羊肉干pH值的变化

发酵剂与木瓜蛋白酶对发酵羊肉干加工过程pH值变化的影响见图2。

图2 发酵剂与木瓜蛋白酶对发酵羊肉干加工过程pH值变化的影响Fig.2 Effects of starter culture and papain on pH value changes of the fermented dry mutton in the production process

由图2知，原料肉pH值为5.74，酸度接近排酸后新鲜原料肉酸度值。腌制结束，各组pH值虽有小幅降低，但与原料肉pH值相比差异不显著（P＞0.05）。0.5 d～2 d发酵期间，4组肉干pH值下降速率显著升高；添加发酵剂可能促进原料肉中碳水化合物快速分解为乳酸等小分子有机酸，促使单一组和复配组羊肉干pH值下降速率显著高于对照和木瓜蛋白酶组（P＜0.05），而对照组与木瓜蛋白酶组及单一组与复配组的组间pH值差异不显著（P＞0.05），说明添加戊糖片球菌可显著快速降低发酵羊肉干pH值。在2 d～4 d干燥期间，温度和湿度（RH）低至14℃和75%～85%，低温和低湿条件可能影响产酸酶类活性降低产酸速率，也可能由于蛋白质分解产生氨类等碱性物质中和羊肉干中乳酸等酸性物质，促使肉干pH值在干燥后期呈现上升趋势[14-15]；干燥结束，复配组和单一组pH值分别上升至5.56、5.58，其它两组pH值升至5.66。

2.3 发酵羊肉干Aw的变化

水分活度（water activity，Aw）是衡量食品保质期长短的一个重要物理指标，当Aw＞0.9时，大部分腐败菌及致病菌可正常生长；当Aw低于0.9时，大部分细菌及有害菌生长均受到抑制；Aw＜0.6时，霉菌及耐盐细菌代谢活性几乎为零[16-17]。发酵剂与木瓜蛋白酶对发酵羊肉干加工过程Aw值变化的影响见图3。

图3 发酵剂与木瓜蛋白酶对发酵羊肉干加工过程Aw值变化的影响Fig.3 Effects of starter culture and papain on Aw value changes of the fermented dry mutton in the production process

由图3可知，羊肉干在制作初期水分活度变化微小，可能由于腌制时添加配料促使腌制时Aw略高于原料肉。在0.5 d～2 d发酵期间，羊肉干所处环境温度较高，湿度接近95%，环境条件抑制了羊肉干内部水分向外部环境迁移的速率，导致发酵结束羊肉干Aw下降幅度较小。在2 d～4 d干燥过程中，由于pH值降低，接近蛋白质等电点，致使蛋白质对水分吸附能力下降，此时羊肉干Aw相对腌制结束，变化差异较为显著（P＜0.05），复配组、单一组、木瓜蛋白酶组及对照组Aw 分别为 0.923、0.924、0.933、0.933，对比说明添加戊糖片球菌有助羊肉干水分活度的降低。4 d～7 d干燥阶段，温度和RH分别被降到13℃、65%，由于温度和湿度急剧降低，环境较为干燥，环境条件致使羊肉干内部水分大幅向外迁移，成熟结束各组Aw显著低于干燥结束对应组，且复配组降到组中最低为0.801。

2.4 发酵羊肉干硫代巴比妥酸反应产物（the thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）的变化

TBARS实为一种脂质过氧化产物，大量积累不利于产品安全性，据研究报道，TBARS指数越高代表脂质被氧化氧化程度越高；含量处于0.6～2.0时[18]，产品仍为正常，若超过2.0说明产品脂质氧化过程，TBARS过度积累，给产品造成极大危害性。发酵剂与木瓜蛋白酶对发酵羊肉干加工过程TBARS变化的影响见图4。

图4 发酵剂与木瓜蛋白酶对发酵羊肉干加工过程TBARS变化的影响Fig.4 Effects of starter culture and papain on TBARS changes of the fermented dry mutton in the production process

由图4可知，原料肉TBARS为0.15；腌制结束，所测得4组TBARS均上升，说明在原料肉切割和腌制过程成中存在脂质微量氧化；发酵过程中，TBARS仍呈上升趋势，但单一组TBARS（0.25）显著低于其它3组；在干燥过程，木瓜蛋白酶组TBARS值（0.68）最高，而单一组最低（0.46），说明添加木瓜蛋白酶可能会促使脂质过度氧化；干燥第二阶段，4组TBARS仍快速上升，通过图4可知仍是木瓜蛋白酶组TBARS（1.251）最高，而单一发酵剂组（0.585）为组中最低，而戊糖片球菌与木瓜蛋白酶复配组TBARS也高为0.827，说明添加木瓜蛋白酶在促进蛋白质分解的过程中可能加速脂质的氧化。因而添加戊糖片球菌可有效抑制脂质过氧化，保证产品质量和安全性。

2.5 发酵羊肉干质构的变化

质构可整体反应产品组织状态及食用口感。肉干硬度与嫩度呈线性负相关，硬度越大则表示咀嚼时所需力将越大，嫩度则越差；弹性表示在所受外力撤去时的回复程度；咀嚼性表示固体食品咀嚼到可吞咽时所需功，数值上等同于弹性、硬度与内聚性的乘积；内聚性表示对食品咀嚼时抵抗性[19-20]。

从表2可知，木瓜蛋白酶组和对照组硬度分别为3902.399、6729.667N，说明添加木瓜蛋白酶可显著改善羊肉干嫩度（P＜0.05），单一组和复配组硬度分别为2418.78、4650.91N，再次说明通过添加木瓜蛋白酶可能显著促进肌原纤维蛋白降解，进而改善羊肉干嫩度。比较4组弹性可知，木瓜蛋白酶组与单一发酵剂组弹性显著低于对照组和复配组（P＜0.05），说明单一添加木瓜蛋白酶或发酵剂有助于促进蛋白质降解，弹性下降，而复配组弹性高于其它3组，说明复合添加酶与发酵剂可整体提高羊肉干弹性；单一组和木瓜蛋白酶组内聚性显著低于对照组和复配组（P＜0.05），且对照组内聚性低于复配组；复配组与木瓜蛋白酶组咀嚼性差异不显著（P＞0.05），但显著低于其它两组；复配组回复性显著高于其它3组。

2.6 发酵羊肉干成品率

发酵剂及木瓜蛋白酶对发酵羊肉干加工过程成品率的影响见图5。

羊肉中水分主要为自由水和结合水，环境条件改变有助于羊肉干中自由水向环境中迁移，结合水由于氢键、范德华力束缚，致使其较难丢失。因为在制作初期及腌制和发酵期，环境RH接近95%，因此此时羊肉干水分丢失较少；随着环境温度和RH急剧下降，促使环境与羊肉干内部形成一定湿度梯度，致使羊肉干内部水分不断向环境中迁移，使得羊肉干在干燥期水分含量急剧下降，由于发酵剂添加使得单一组和复配组水分下降速率快于其它两组，对照组和木瓜蛋白酶组成品相率高于其它量发酵组；在成熟过程，环境RH降到最低65%，致使羊肉干在成熟3 d下降幅度达到最大，单一组和复配组成品率降到组中最低。根据试验制作要求，通过添加发酵剂可显著缩短制作周期，降低制作成本。

3 讨论与讨论

本试验设置木瓜蛋白酶组和单一发酵剂组，目的是对比木瓜蛋白酶在制作过程对羊肉干嫩化效果。有研究表明，在嫩肉粉中添加木瓜蛋白酶，可使得肉类食物在加热烹煮后，口感变得较为松软和嫩滑。木瓜蛋白酶能够快速降解肌原纤维和结缔组织，特别对于含有筋腱较多的牛肉而言，添加木瓜蛋白酶更能使得产品口感松软、易于咀嚼。并且试验中通过添加，有助于改善羊肉干嫩度及咀嚼特性，但其对羊肉干pH值、Aw、成品率影响较小。木瓜蛋白酶促进蛋白质降解，蛋白质分解可能对脂质氧化分解有一定贡献作用，使得木瓜蛋白酶组羊肉干TBARS值高于其它组。试验中通过添加具有较强抗脂质过氧化性、清除羟自由基和DPPH自由基特性的戊糖片球菌不但可快速降低羊肉干pH值、Aw，并且也有助于改善羊肉干嫩度和咀嚼特性，相比木瓜蛋白酶可有效抑制脂质过氧化，在羊肉干成熟结束单一发酵剂TBARS均低于其它三组，且低于0.6。说明添加木瓜蛋白酶可以改善羊肉干口感特性，添加发酵剂可有效抑制脂质过氧化。

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