襄麦冬多糖及皂苷体外活性研究

2018-07-04陈哲冯佳悦曹诚柯炎波杨润余海忠王海燕

食品研究与开发 2018年13期

陈哲，冯佳悦，曹诚，柯炎波，杨润，余海忠，王海燕

（湖北文理学院食品科学技术学院·化学工程学院，湖北襄阳441053）

麦冬（Ophiopogon japonicus）首次被人知晓于《神农本草经》，系百合科沿阶草属多年生常绿草本植物麦冬的块根[1]。按其产地不同主要分为湖北麦冬、川麦冬以及杭麦冬[2]。其中湖北麦冬（Liriope spicata Lour.var.prolifera Y.T.Ma），因主产于湖北襄阳欧庙一带而又俗称为襄麦冬。作为道地药材，襄麦冬已获国家地理标志产品保护，由于其块根单产高于川、杭麦冬，且生产周期短，目前已成为中药麦冬的主流商品[3]。麦冬含有多糖、甾体皂苷、高异黄酮和氨基酸等成分[4]。对于其主要活性成分之一的麦冬多糖和皂苷的研究如今国内外蒸蒸日上，研究结果也日新月异。诸多研究发现麦冬多糖和皂苷具有较高的药理活性和医用价值，例如保护心血管内皮细胞[5]，改善心肌缺血[6]、调节免疫[7]、改善三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的大鼠结肠炎[8]、抗衰老[9]、抗糖尿病作用[10]、抗肿瘤作用[11]等。前期对襄麦冬多糖的提取工艺[12]以及襄麦冬皂苷B诱导肿瘤细胞分化[13]进行了研究，本研究拟对襄麦冬多糖的体外清除活性以及襄麦冬皂苷B的抑菌活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

襄麦冬：湖北省襄阳市欧庙镇。襄麦冬皂苷B：上海源叶生物科技有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由湖北文理学院食品科学技术学院·化学工程学院孙永林老师惠赠。葡萄糖标准品：西安化学试剂厂；蒽酮（分析纯）：天津市科密欧化学试剂开发中心；95%浓硫酸：展望化工试剂有限公司；95%乙醇：西陇化工股份有限公司；无水乙醇：西陇化工股份有限公司；DPPH：上海源叶生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

LD-Y300A粉碎机：上海顶帅电器有限公司；RE-5205旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HX-OIN抽滤机：恒信世纪科技有限公司；UV-2600PC紫外/可见光分光光度计：岛津企业管理（中国）有限公司；GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；AL204型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DL-CJ-2NDI超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；LKH-250OF生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 襄麦冬多糖的提取及其抗氧化活性研究

1.3.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制

1）试验原理

多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，并且迅速脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮脱水缩合，反应生成的糠醛的衍生物在波长625 nm处有峰值，反应溶液呈现蓝绿色，反应液颜色与溶液中所含的糖的浓度成正比[14]。

2）标准葡萄糖溶液的配制

用电子天平称取0.02 g的标准葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后定容于200 mL的容量瓶（容量瓶使用前采用蒸馏水润洗）中配成0.1 mg/mL的葡萄糖溶液混匀待用。

3）葡萄糖溶液标准曲线回归方程的建立

取6支试管，用准确吸取0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液 0、2、4、6、8、10 mL，再取蒸馏水 10、8、6、4、2、0 mL依次注入6支试管摇匀；6支试管分别加入4 mL的0.2%蒽酮-硫酸溶液，迅速浸入冷水中冷却，各管冷却后一同放入沸水水浴（试管口加盖防止蒸发），准确沸水浴10分钟后取出，用冷水冷却后放至室温，倒入比色皿中，于波长625 nm处比色，测量吸光度。以同样处理过的蒸馏水作为空白进行比色，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，做出葡萄糖标准曲线。

1.3.1.2 襄麦冬多糖的提取

1）热水浸提醇沉法原理

由于多糖溶于水而不溶于醇、醚和丙酮等有机溶剂，热水浸提醇沉法[15]主要利用水的热力作用致使细胞发生质壁分离，让水作为溶剂渗透进细胞壁和细胞质当中，从而溶解液泡当中的物质，使这些物质能够通过细胞壁，扩散至外部溶剂中[16]。醇沉就是利用杂质溶于乙醇但有效成分不能溶于乙醇的特性，将杂质去除[17]。

2）热水浸提醇沉法实验流程

采用文献[18-19]中麦冬热水浸提醇沉法的最优工艺条件提取襄麦冬多糖，选择提取率高者进行后续实验。将麦冬置于60℃的干燥箱中24h烘干后使用植物粉碎机将其粉碎成粉末，并使用保鲜膜密封保存（防止受潮而影响后期实验）备用。取两个烧杯分别标记为1号代表第一种方法、2号代表第二种方法，用电子天平分别称取80 g襄麦冬粉末，分别加入800、2400 mL蒸馏水，待水浴锅达到80℃时放入烧杯恒温水浴2 h，再将所得溶液抽滤，除去沉淀，将所得溶液用旋转蒸发仪在60℃下浓缩，1号加入4倍体积的80%的乙醇[20]，2号加入4倍体积的95%的乙醇，两管均醇沉过夜，之后9000 r/min，离心15 min后除去溶液，再将所得沉淀干燥，即得多糖制品。试验重复4次取平均值。参照参考文献[21]，称取多糖制品，加入蒸馏水稀释，根据标准曲线公式计算得到多糖浓度，根据以下公式计算多糖含量：

多糖含量/%=[（c×V）/m]×100

式中：c为多糖浓度，（mg/mL）；V 为多糖体积，mL；m 为多糖的质量，mg。

1.3.1.3 襄麦冬多糖的体外抗氧化活性测定

1）襄麦冬多糖清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是一种具有一定稳定性的有机自由基[21]，它的溶液具有特征的紫红色吸收峰，当存在自由基清除剂的时候，由于DPPH自由基与其单电子配对而导致其吸收逐渐消失，其褪色程度与它所接受到的单电子数成定量关系，因此可以用分光光度法进行定量分析[22]。

参照参考文献[23]，取5支10 mL的容量瓶分别标记为 1、2、3、4、5，向 5 支容量瓶中分别加入 0.1 mg/mL的多糖溶液 2、4、6、8、10 mL，然后加入蒸馏水定容，制成浓度依次为 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的襄麦冬多糖的稀释液，摇匀待用。

取 5 支试管，分别注入 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的襄麦冬多糖的稀释液1 mL和0.2 mmol/L的DPPH溶液（溶剂为无水乙醇，现配现用。）1 mL振荡摇匀，静置30 min后在波长517nm处测得吸光度Ai，对照组用1 mL 50%的乙醇代替DPPH与上述5组溶液1 mL振荡摇匀在波长517nm处测得吸光度Aj，以1 mL DPPH与1 mL 50%乙醇的混合溶液在波长517 nm处测得的吸光度Ac，以1 mL蒸馏水和1 mL 50%乙醇混合溶液作为空白调零。计算襄麦冬多糖对DPPH自由基的清除率公式表示为：

清除率/%=[Ac-（Ai-Aj）]/Ac×100

2）襄麦冬多糖清除羟自由基（·OH）的能力

参照参考文献[24]，取5支试管依次向其中加入2.0 mmol/L 的 FeSO4溶液 2.0 mL、1.0 mmol/L H2O2溶液2 mL，摇匀后再加入6.0 mmol/L水杨酸3.0 mL，摇匀后于37℃水浴加热15 min。水浴结束后于波长510 nm处测得吸光度A0。之后向5支试管中分别加入0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的襄麦冬多糖的稀释液1 mL，水浴加热15 min，等待加热结束后再次分别测量其吸光度AX。用2 mL蒸馏水代替1.0 mmol/L H2O2重复上述实验，在510 nm处测得吸光度AX0，试验重复3次取平均值。襄麦冬多糖羟自由基清除率计算公式为：清除率/%=[A0-（AX-AX0）]/A0×100

3）襄麦冬多糖清除超氧阴离子自由基（O2-·）的能力

采用邻苯三酚自氧化法来检测麦冬多糖对超氧阴离子自由基（O-2·）的清除能力。首先将PH8.2的Tris-HCL缓冲液与邻苯三酚溶液于25℃恒温水浴箱中保温20 min，取5支试管分别加入4.5 mL Tris-HCL缓冲液，再分别加入 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的襄麦冬多糖的稀释液0.4 mL，以及邻苯三酚溶液0.1 mL，振荡摇匀后在25℃下恒温水浴，准确反应4 min，立即加入10 mol/L HCl溶液2滴终止反应，于波长325nm处测得样品吸光度A2[25]。以蒸馏水代替多糖溶液作为对照吸光度A1，以缓冲液和蒸馏水的混合溶液作为空白调零。襄麦冬多糖超氧阴离子自由基（O2-·）的清除率公式表示为：

清除率/%=[（A1-A2）/A1]×100

1.3.2 襄麦冬皂苷B抑菌活性研究

1.3.2.1 培养基的制备

称取牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，琼脂15 g，氯化钠5 g，将1000 mL水加热至沸腾后，再将牛肉膏、蛋白胨、琼脂和氯化钠加入溶解。pH值调至7.4，将培养基放入高压蒸汽灭菌锅中温度为121℃，灭菌20 min，放入干燥箱中备用。

1.3.2.2 菌悬液的制备

先将菌种接于平板，放入生化培养箱内37℃培养24 h。取9只已灭菌的试管依次从0开始编号，然后在编号为0的试管中加入10 mL无菌生理盐水，其他8只试管中加入9 mL无菌生理盐水。然后用接种环从平板中挑取一定量的菌于0号试管中，以其做为稀释的起始浓度，采用10倍系列稀释依次得到1至8号菌液。取3号和6号试管备用。

1.3.2.3 含菌平板的制备

把已灭好菌的牛肉膏蛋白胨培养基分别倒入8个培养皿中，等培养基凝固后，用移液枪吸取菌悬液0.3 mL加入培养皿内，然后用涂布勾将加入的菌悬液涂抹均匀，制成含菌平板。

1.3.2.4 抑菌试验

参照参考文献[26]，用无菌水溶解襄麦冬皂苷B并将其分别配制成0.5、1.0、2.0、4.0 mg/m L的皂苷溶液。将已灭菌的直径为5.5 mm滤纸片分别浸入上述4种不同浓度的麦冬皂苷溶液中浸泡2 h。取出待其自然干燥后，用紫外线照射灭菌10 min～15 min。用无菌镊子将浸透4种浓度麦冬皂苷溶液的滤纸片放在含菌平板上。然后将已处理好的培养皿放到生化培养箱中，在温度为37℃培养24 h，用游标卡尺测定抑菌圈的大小，判断不同浓度的麦冬皂苷溶液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。

1.3.2.5 抑菌效果的判定标准

抑菌圈直径＞15 mm时为高度敏感，10 mm～15 mm时为中度敏感，7 mm～9 mm时为低度敏感，无抑菌圈者为不敏感。

1.3.3 数据处理

所有数据采用Excel、SPSS 16.0进行处理并做统计分析，配对t检验比较两种最优工艺提取多糖含量，P＜0.05为有统计学意义。

2 实验结果

2.1 葡萄糖标准曲线

以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 The standard curve of glucose

由图1可知，回归方程y=8.4686x+0.0146，R2=0.9981，回归方程线性良好。

2.2 襄麦冬多糖的提取

比较热水浸提醇沉法的两种最优工艺提取的襄麦冬多糖含量，结果见表1。

表1 不同提取条件下的襄麦冬多糖含量（±s，n=4）Table 1 Polysaccharide content under different extraction conditions from Liriope Spicata Lour.var.Prolifera Y.T.Ma

试验方法多糖含量/% P值（t检验）143.25±0.83 0.075241.94±0.24

由表1中数据可知，80 g襄麦冬粉末中加入800 mL的蒸馏水，80℃水浴锅中恒温水浴2 h后旋转蒸发，再用80%的乙醇醇沉过夜所得到的多糖含量较高。由于P=0.075＞0.05，可知1号提取麦冬多糖含量与2号没有显著差异，选择含量较高的1号方法进行后续实验。

2.3 襄麦冬多糖的体外抗氧化活性测定结果

2.3.1 襄麦冬多糖清除DPPH自由基的能力

对襄麦冬体外清除DPPH自由基的能力进行研究，结果如图2所示。

图2 襄麦冬多糖体外清除DPPH自由基的能力Fig.2 Effect of polysaccharide on the DPPH free radical scavenging

由图2可以看出，麦冬多糖对DPPH自由基具有一定的清除能力，当襄麦冬多糖浓度为0.1 mg/mL时，对DPPH自由基的清除作用最强，高达21.08%，并且随着稀释倍数的增加，溶液中多糖含量的降低，对DPPH自由基的清除能力也有相应的降低，呈现正相关的关系。

2.3.2 襄麦冬多糖清除羟自由基（·OH）的能力

采用了水杨酸法对襄麦冬体外清除羟自由基的能力进行了研究，结果如图3所示。

图3 襄麦冬多糖体外清除羟自由基（·OH）的能力Fig.3 Effect of polysaccharide on the hydroxyl radical（·OH）scavenging

根据图3的数据显示，襄麦冬多糖对于羟自由基具有一定的清除能力，并且随着多糖浓度的增加，对于羟自由基的清除能力也具有相应的加强，当襄麦冬多糖浓度为0.1 mg/mL时对羟自由基清除作用最强，高达25.69%。

2.3.3 襄麦冬多糖清除超氧阴离子自由基（O2-·）的能力

采用邻苯三酚自氧化法对襄麦冬体外清除超氧阴离子自由基的能力进行研究，结果如图4所示。

图4 襄麦冬多糖体外清除超氧阴离子自由基的能力Fig.4 Effect of polysaccharide on the scavenging activity of superoxide anion radical

根据图4可以看出，襄麦冬多糖对于超氧阴离子自由基的清除能力较强，当襄麦冬浓度为0.1 mg/mL时，襄麦冬多糖对超氧阴离子的清除能力最高达70.83%。可以看出襄麦冬多糖对于超氧阴离子自由基的清除作用与溶液中多糖含量具有一定的关系，随着襄麦冬多糖浓度的增加，对于超氧阴离子自由基的清除能力也相应的增强。

2.4 襄麦冬皂苷B体外抑菌活性检测结果

采用滤纸片法对襄麦冬皂苷B的抑菌活性进行研究，结果见表2。

表2 不同浓度的襄麦冬皂苷B对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果（±s）Table 2 Bacteriostatic effect of different concentrations liriopesides B from Liriope Spicata Lour.var.Prolifera Y.T.Ma（±s）mm

注：-表示无明显抑菌圈。

3 号 - - 11.63±0.33 17.05±0.676号 - - - -襄麦冬皂苷B浓度0.5 mg/mL 1.0 mg/mL 2.0 mg/mL 4.0 mg/mL大肠杆菌 3号 - - 10.83±0.82 14.89±0.506号 - - - -金黄色葡萄球菌菌种试管号

由表2可得，在襄麦冬皂苷B溶液浓度为2.0、4.0 mg/mL时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果比较明显，金黄色葡萄球菌对皂苷溶液比大肠杆菌更加敏感。其中金黄色葡萄球菌对4.0 mg/mL的襄麦冬皂苷B极度敏感。

3 结论与讨论

热水浸提醇沉法是目前较为常见提取多糖的方法之一，这种方法虽然所消耗的劳动力强度也相对较大[27]，并且多糖是一种热敏性的物质[28]，长时间处于高温环境下会影响到它的生物活性，但是热水浸提醇沉的方法提取多糖对实验设备需求不高，而且操作非常简单，成本低廉，准确度也较高，对于大规模的生产以及大部分实验室的提取工艺都很适合[29]。当然除了热水浸提醇沉法之外，还有很多方法可以提取多糖，例如超声波提取法、酶提取法以及微波提取法等。其中超声波提取法[30]是利用超声产生的强烈的空气振荡，致使细胞壁破裂，更有效的加速有效成分进入溶剂，减少了提取时间，加大了提取效率，但是这种方法相对热水浸提醇沉法的方法来说对设备的需求要高出很多，并不适合大规模的生产操作，并且可溶性的多糖随着超声作用时间加长还可能会发生降解，并溶解在乙醇溶液中，因此会减少多糖的提取量。襄麦冬多糖体外抗氧化活性检测表明其对自由基具有一定的清除能力，其中对超氧阴离子自由基清除率最高，羟自由基次之。主要原因在于，多糖可以与超氧阴离子自由基发生氧化反应，从而达到清除目的，对于单线态氧，可以将激发能传递给多糖，使得多糖处于激发态而它自身则回到基态；羟自由基可以快速的摄取多糖碳氢链上的氢原子结合成水，而多糖的碳原子上则留下一个单电子，成为碳自由基，氧化形成过氧自由基，最后分解成对机体无害的产物[31]。研究表明，植物提取物罗汉果花皂苷对细菌、霉菌和酿酒酵母均具有较强的抑菌活性[32]。玉米须中总皂苷对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和白葡萄球菌有明显的抑制作用[33]。柚皮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，对沙门氏菌的抑制作用较弱[34]。本研究结果表明，襄麦冬皂苷B具有明显的抑菌活性，其对金黄色葡萄球菌的抑制能力强于大肠杆菌。

综上所述，襄麦冬多糖对自由基具有一定的清除能力，其中对超氧阴离子自由基的清除作用相对较强，最高达到70.83%。襄麦冬皂苷B对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有明显的抑菌活性，尤其对金黄色葡萄球菌的抑菌作用更强，其最大抑菌圈为（17.05±0.67）mm，此研究成果可为襄麦冬产品的进一步开发利用提供重要理论参考。

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