超声波辅助提取翠云草中穗花杉双黄酮工艺的响应面优化

2018-07-04赖红芳黄秀香石祖玲

食品研究与开发 2018年13期

赖红芳，黄秀香，石祖玲

（河池学院化学与生物工程学院，广西宜州546300）

翠云草为卷柏属植物翠云草 [Selaginella uncinata（Desv.）spring]的全草，别名为蓝草、龙须、蓝地柏、绿绒草等，在广西、广东、福建、浙江、安徽以及西南各地等都普遍存在，资源非常丰富[1-2]。其味甘苦，性寒，具有清热利湿、解毒消淤、止血等功效[3]，还含有丰富的黄酮类、有机酸类、氨基酸、类酚类、生物活性多糖等对人体有益的活性物质[4-5]。其中的穗花杉双黄酮不仅为卷柏药材化学检验的对照品和质量控制的指标成分[6]，还具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、血管舒张等[7-9]多种生理活性。从文献报道来看对翠云草中穗花杉双黄酮的研究并不多，本文拟采用响应面分析法优化翠云草中穗花杉双黄酮的超声波辅助提取工艺。利用超声波提取节能、绿色等优点，结合响应面分析法[10]，在单因素的基础上，研究几种因素间交互作用[11-12]。寻求翠云草中穗花杉双黄酮的最佳提取工艺条件，为其在工业化生产中提供有利的理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

RE-52A型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；Agilent 8453型紫外可见分光光度仪：美国安捷伦科技公司；AUW220D型十万分之一天平：日本岛津公司；KQ2200DE型数控超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司。

1.2 材料与试剂

翠云草：采自广西宜州市，经河池学院化学与生物工程学院邓晰朝副教授鉴定为翠云草（Selaginella uncinata（Desv.）Spring）全草。穗花杉双黄酮（批号：MUST-15012505，纯度大于99.5%）：成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇、丙酮、无水乙醇、氯仿均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 最大吸收波长的选择

分别移取1.00 mL穗花杉双黄酮标准溶液和0.5 mL翠云草提取液于10 mL比色管中，加入体积分数为80%的乙醇定容至10.00 mL，以80%乙醇为空白试剂，用紫外-可见分光光度计全波长扫描。由两者的谱图可知在269 nm下有最大吸收峰，故将检测的最大吸收波长选定为269 nm。

2.2 标准曲线的绘制

精确称取8.4 mg穗花杉双黄酮样品，用80%乙醇稀释定容至50 mL容量瓶中，制得0.1680 mg/mL穗花杉双黄酮标准溶液。分别吸取标准液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于比色管中，用80%乙醇稀释至10 mL。以80%乙醇做空白在269 nm处测其吸光度，绘制标准曲线。结果显示穗花杉双黄酮的回归方程为：y=74.455x+0.0247，r2=0.9997，线性范围 0.0021 mg/mL～0.0105 mg/mL，结果表明穗花杉双黄酮在线性范围内浓度与吸光度呈良好线性关系。

2.3 提取溶剂的选择

准确称量5 g翠云草粉末，以功率为100 W，料液比为 1∶20（g/mL），提取温度为60℃，超声时间为0.5 h，提取溶剂分别为80%乙醇，80%丙酮，80%氯仿，80%甲醇，超声两次，合并两次滤液，冷却后用80%乙醇定容至100 mL，移取0.50 mL提取液于比色管中，用80%乙醇稀释至25 mL，按2.2测其吸光度，测定不同溶剂提取的穗花杉双黄酮的提取率，选择合适的提取溶剂，结果见表1。

表1 溶剂的影响Table 1 Effects of solvents

结果显示用丙酮作为提取剂测得的提取率最高，但是其波谱图周围含有杂峰，对穗花杉双黄酮含量测定影响很大。而用乙醇作为提取剂测得的结果仅此于用丙酮，故考虑到简便、价格便宜、污染小等特点，最终确定选择乙醇为最佳提取剂。

2.4 翠云草中穗花杉双黄酮的测定

将干燥翠云草剪碎后粉碎，过40目筛，保存备用。准确称量5 g翠云草粉末，以功率为100 W，料液比为1∶20（g/mL），提取溶剂为80%乙醇，提取温度为60℃，超声时间为0.5 h，超声两次，合并两次滤液，冷却后用80%乙醇定容至100 mL，移取0.50 mL提取液于比色管中，用80%乙醇稀释至25 mL，按2.2测其吸光度，计算其提取率。

2.5 单因素试验

2.5.1 料液比对翠云草穗花杉双黄酮提取率的影响

准确称量5 g翠云草粉末，以功率为100 W，提取溶剂为80%乙醇，提取温度为60℃，超声时间为0.5 h，改变料液比为 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）进行超声提取，合并两次滤液，冷却后用80%乙醇定容至100 mL，移取0.50 mL提取液于比色管中，用80%乙醇稀释至25 mL，按2.2测其吸光度，计算其提取率。结果见图1。

图1 料液比对翠云草穗花杉双黄酮提取率的影响Fig.1 Effects of solid/liquid ratio on extraction rate of amentoflavone

由图1可以看出，提取率随料液比增加而增大，在1∶20（g/mL）时达到最高值，故将料液比因素考察水平定为 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）。

2.5.2 超声温度对翠云草穗花杉双黄酮提取率的影响

准确称量5 g翠云草粉末，以功率为100 W，料液比为1∶20（g/mL），提取溶剂为80%乙醇，超声时间为0.5 h，改变超声温度为 40、50、60、70、80 ℃进行超声提取，合并两次滤液，冷却后用80%乙醇定容至100 mL，移取0.50 mL提取液于比色管中，用80%乙醇稀释至25 mL，按2.2测其吸光度，计算其提取率。结果见图2。

图2 超声温度对翠云草穗花杉双黄酮提取率的影响Fig.2 Effects of temperature on extraction rate of amentoflavone

由图2可以看出，提取率随温度升高而增大，在70℃时达到最大值，80℃时，提取率反而降低，说明温度过高有可能使穗花杉双黄酮变性氧化，故将温度因素考察水平定为50、60、70℃。

2.5.3 超声功率对翠云草穗花杉双黄酮提取率的影响

准确称量5g翠云草粉末，以料液比为1∶20（g/mL），提取溶剂为80%乙醇，提取温度为60℃，超声时间为 0.5 h，改变提取功率为 60、70、80、90、100 W 进行超声提取，合并两次滤液，冷却后用80%乙醇定容至100 mL，移取0.50 mL提取液于比色管中，用80%乙醇稀释至25 mL，按2.2测其吸光度，计算其提取率。结果见图3。

图3 超声功率对翠云草穗花杉双黄酮提取率的影响Fig.3 Effects of power on extraction rate of amentoflavone

由图3可以看出，最佳提取功率为90 W，故将功率因素考察水平定为80、90、100 W。

2.5.4 溶剂浓度对翠云草穗花杉双黄酮提取率的影响

准确称量5 g翠云草粉末，以功率为100 W，料液比为1∶20（g/mL），提取温度为 60℃，超声时间为 0.5 h，改变乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%进行超声提取，合并两次滤液，冷却后用80%乙醇定容至100 mL，移取0.50 mL提取液于比色管中，用80%乙醇稀释至25 mL，按2.2测其吸光度，计算其提取率。结果见图4。

图4 乙醇浓度对翠云草穗花杉双黄酮提取率的影响Fig.4 Effects of ethanol concentration on extraction rate of amentoflavone

由图4可以看出，最佳乙醇浓度为60%，故将乙醇浓度因素考察水平定为50%、60%、70%。

2.6 响应面试验及显著性分析

根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，综合单因素及正交试验影响的试验结果，选取料液比、提取温度、提取功率、乙醇浓度4个因素，在正交试验的基础上采用三水平四因素的响应面分析法，试验因素与水平设计见表2。以功率A、温度B、料液比C、乙醇浓度D为自变量，穗花杉双黄酮的提取率为响应值，平均每组平行3次，试验方案及试验结果见表3。

表2 响应面分析法的因素水平表Table 2 Factors and levels of response surfaces Method

表3 响应面分析结果Table 3 The results of response surface analysis

通过Design-Espwrt-8.0.6软件对表中翠云草中穗花杉双黄酮提取率数据进行响应面回归分析，得到响应变量（功率A、温度B、料液比C、乙醇浓度D）与响应值（穗花杉双黄酮提取率%）之间的多元二次回归方程。

为了说明二次回归方程模型的有效性及各因素对响应值的影响程度，对回归方程模型进行方差分析，结果见表4。

表4 方差分析表Table 4 Table of variance analysis

由表4可知：模型的显著水平为0.0009（小于0.01），且R2=0.921488，所以这个回归方差模型是极显著的。说明试验设计可靠，所拟合的二次回归方程合适，应用此模型可以预测不同提取条件下翠云草穗花杉双黄酮的提取率[13]。由P值可知，方程一次项中乙醇浓度D极显著，温度B和料液比C显著；交互项中BD显著；二次项 A2、B2、C2、D2均表现为极显著，说明各个因素对翠云草穗花杉双黄酮提取率的影响不是简单的线性关系。各个因素对翠云草穗花杉双黄酮提取率的影响大小排序为：乙醇浓度＞温度＞料液比＞功率。

2.7 响应面分析

利用等高线和三维曲面图可以更加直观地分析各因素及它们的交互作用对响应值的影响，见图5。

由图5可知，响应面的坡度直接反映出各因素的交互作用及对穗花杉双黄酮提取率的显著性[14]。以图5I为例，温度变化的响应值大于功率变化的响应值，说明在交互作用中温度变化对穗花杉双黄酮提取率的影响大于料液比变化；以此类推，各个因素的影响大小排序为：乙醇浓度＞温度＞料液比＞功率。这与方差分析的结果一致。各个因素之间对穗花杉双黄酮提取率有显著的交互作用，如图5Ⅰ所示，随着提取温度和提取功率增大，穗花杉双黄酮提取率先快速提高后缓慢降低，由此可见，适当的增大提取温度和提取功率，可以一定程度提高穗花杉双黄酮提取率。但过度增加并不能提高得率。其他图的分析与图5Ⅰ相似，因此，在实际操作过程中，应慎重控制提取温度、提取功率、乙醇浓度及料液比，以获得较高的提取率[15]。

图5 乙醇浓度、料液比、提取功率和提取温度对穗花杉双黄酮得率的交互影响Fig.5 Interaction effects between ethanol concentration，solid/liquid ratio，power and temperature on the amentoflavone yield

2.8 最优提取工艺确定及模型验证

由响应面图分析可知，翠云草中穗花杉双黄酮提取的最佳工艺条件为：功率为90.28W、温度为71.03℃、料液比为1∶19.29（g/mL）、乙醇浓度为61.74%。按此条件预测翠云草穗花杉双黄酮提取率为1.62%。结合实际条件将试验条件修正为：功率为90 W、温度为71℃、料液比为 1∶19（g/mL）、乙醇浓度为 62%，此条件下穗花杉双黄酮提取率为1.53%（平行5次），与预测值相差为5.55%。由于本试验采用的是KQ2200DE型数控超声波清洗器，功率和温度有小偏差，故测量值与预测值之间存在有偏差，但采用响应面试验优化提取翠云草穗花杉双黄酮的提取工艺还是有较好的可行性。

3 结论与讨论

采用Box－Behnken结合响应面分析法优化超声辅助提取翠云草中穗花杉双黄酮，最佳提取条件为：功率为90 W、温度为 71℃、料液比为 1∶19（g/mL）、乙醇浓度为62%，此条件下穗花杉双黄酮提取率为1.53%，与预测值相差为5.55%。该回归方程较真实地反应了各因素对穗花杉双黄酮提取得率的影响，表明优化超声辅助提取翠云草中穗花杉双黄酮的提取工艺具有很好的参考价值和实用价值。

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