Gli通过PI3K/AKT促进食管鳞癌KYSE-30上皮-间质转化研究

米 源，杜媛鲲，刘庆熠，廖海江，陈 阁，王 雷

食管癌是全世界最常见的恶性消化道肿瘤之一，在肿瘤相关的致死原因中排名第6位[1]。既往中晚期食管癌的治疗策略以手术为主，放化疗为辅，但多年来五年生存率并没有显著改善，提示进一步了解食管鳞癌细胞的生物学行为对于肿瘤治疗至关重要。Hedgehog信号通路是近年来研究热点之一，在非小细胞肺癌[2]、胰腺癌[3]、基底细胞癌[4]和肝癌[5]等多种实体肿瘤中异常活化，与肿瘤的发生发展存在密切联系，其中Gli作为Hedgehog通路下游的核心组分在信号传导中发挥核心调控作用，但其调控肿瘤转移的分子机制尚未完全阐明。

近年来研究[6-7]显示Hedgehog信号通路与PI3K/AKT信号通路之间存在着密切联系，通过交叉调控现象促进肿瘤的进展，然而，在食管鳞癌组织中Hedgehog 信号通路是否通过 PI3K/AKT信号通路发挥作用以及如何影响该信号通路尚缺乏直接证据，阐明上述作用关系对于明确Hedgehog 信号通路调控食管鳞癌细胞侵袭转移的机制至关重要，因此该研究通过分析人食管鳞癌细胞系KYSE-30细胞中的Gli和PI3K/AKT通路的关系进一步研究肿瘤的进展，为肿瘤的治疗提供新的方法。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 人食管鳞癌细胞系KYSE-30 购自英国Sigma-Aldrich公司，青-链霉素购自上海书吉生物有限公司，Taqman 基因表达预混液(美国应用生物系统公司)，Gli1、Gli2、Vimentin、N-cadherin、GAPDH引物及探针均购于美国生命技术公司，Pierce-BCA 蛋白分析试剂盒(美国赛默飞公司)，ECL试剂(赛默飞世尔科技公司)，Gli1、Vimentin单克隆抗体(美国Abcam公司)，GAPDH、AKT和p-AKT单克隆抗体(美国Cell signaling公司)，Gli2、N-cadherin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，GANT61(美国Selleckchem公司)，结晶紫购自美国Sigma公司，N-Shh蛋白(美国EBioscience公司)，RPMI1640和 Ham细胞培养液(美国Gibco公司)，总RNA提取试剂盒(德国 Qiagen公司)，matrigel基质胶(美国BD公司)。

1.1.2主要仪器 ABI Prism 7900HT型荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)，Veriti® 96-Well Thermal Cycler购自美国应用生物系统公司，ELX800多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)，小型 Trans-Blot®转印槽(美国伯乐公司)，NanoDrop 8000全光谱紫外-可见光分光光度计(美国赛默飞公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 在37 ℃、5%CO2培养箱中KYSE-30细胞用含2%胎牛血清，青-链霉素各100 mg/ml， RPMI 1640 和Ham细胞培养液(1 ∶1)培养。

1.2.2实时荧光定量PCR法 将培养的生长状态良好的KYSE-30细胞用0.25%胰酶消化后离心并细胞计数后铺于12孔板，等第2天细胞培养至70%～80%时更换无血清培养基。设DMSO对照组、GANT61组(10 μmol /L)、N-Shh蛋白组(0.5 mg/ml)以及GANT61&N-Shh组(10 μmol /L GANT61处理细胞30 min后0.5 mg/ml N-Shh 处理细胞24 h)。然后按照总RNA说明书提取RNA并上机进行检测，在25 ℃5 min、42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min的反转录条件下进行cDNA的反转录，然后用无R-Nase水稀释10倍后于每孔加cDNA 4.5 μl、Gli1引物及探针0.5 μl、Gli2引物及探针0.5 μl、Vimentin引物及探针0.5 μl、N-cadherin引物及探针0.5 μl和GAPDH引物及探针0.5 μl、Taqman 基因表达预混液5 μl，10 μl/孔，加样在384孔板上并放到ABI 7900HT PCR仪中进行PCR检测， 40个循环并用2-△Ct法进行分析。

1.2.3Western blot法 将处理好的食管鳞癌细胞KYSE-30设DMSO组、GANT61组(10 μmol/L)、N-Shh蛋白组(0.5 mg/ml)以及GANT61&N-Shh组(10 μmol /L GANT61处理30 min后0.5 mg/ml N-Shh 处理细胞)。24 h后收集每组样本总蛋白提取液并用BCA法测定样本总蛋白浓度。以每孔10 μg蛋白上样，在200 V、40 min的反应条件下经Tris/甘氨酸/电泳缓冲液SDS进行电泳。在100 V、40 min条件下移到PVDF膜并封膜1 h。加入一抗Gli1、Gli2、Vimentin、N-Cadherin、AKT、p-AKT、GAPDH并在 4 ℃环境下过夜。第2天收集一抗后加二抗羊抗兔或羊抗鼠(工作浓度均为1 ∶10 000)室温孵育1 h。收集二抗用TBST洗膜，加ECL试剂显色并在X线下曝光显影，实验重复3次。

1.2.3Transwell侵袭实验 将matrigel基质胶置于4 ℃融化，然后用培养基稀释放置于培养箱中待固化。实验分为4组：DMSO组、GANT61组、N-Shh组、GANT61&N-Shh组。收集处理后的KYSE-30吹打为单细胞悬液重悬并以7.5×104个细胞100 μl加到上室，下室加入500 μl 10%血清的培养液，注意防止大气泡的产生，于细胞培养箱中培养24 h。然后将细胞固定、染色后在高倍镜视野(×400)随机选取4个视野，取平均值。重复3次。

1.3统计学处理使用 SPSS 17.0统计软件进行处理，采用方差分析，组间比较采用LSD方法。

2 结果

2.1各组实时荧光定量PCR检测结果PCR结果显示：Gli1、Gli2、Vimentin、N-cadherin mRNA表达各组间差异有统计学意义 (F=293.12，P<0.001；F=613.55，P<0.001；F=549.36，P<0.001；F=1 527.72，P<0.001)。其中GANT61作用于KYSE-30细胞24 h后导致Gli1、Gli2、Vimentin和N-cadherin mRNA的表达水平低于DMSO组，差异有统计学意义(P<0.001)；同样N-Shh组可以上调肿瘤细胞Gli1、Gli2、Vimentin和 N-cadherin的mRNA表达水平，差异有统计学意义(P<0.001)；同样，GANT61&N-Shh组可以部分上调肿瘤细胞Gli1、Gli2、Vimentin和 N-cadherin的mRNA表达水平，差异有统计学意义(P<0.001)。GANT61&N-Shh组与GANT61组相比，Gli1、Gli2、Vimentin和 N-cadherin的mRNA表达水平增高，差异有统计学意义(P<0.001)，见图1。

图1 各组实时荧光定量PCR检测结果

与DMSO组比较：*P<0.001；与GANT61组比较：#P<0.001

2.2各组Westernblot结果Western blot 结果表明：Gli1蛋白、Gli2蛋白、p-AKT蛋白、Vimentin蛋白、N-cadherin蛋白表达各组间差异均有统计学意义(F=786.828，P<0.001；F=1 113.27，P<0.001；F=2 206.05，P<0.001；F=529.04，P<0.001；F=1 416.46，P<0.001)；AKT各组间差异无统计学意义(F=3.45，P=0.072)。其中经GANT61处理KYSE-30细胞24 h后Gli1、Gli2、p-AKT、Vimentin和N-cadherin蛋白表达均显著低于DMSO组，差异均有统计学意义(P<0.001)；同样，N-Shh处理组Gli1、Gli2、p-AKT、Vimentin和N-cadherin蛋白表达均显著增高，差异均有统计学意义(P<0.001)；GANT61&N-Shh组与DMSO对照组相比可以部分上调Gli1、Gli2、p-AKT、Vimentin和N-cadherin蛋白表达，差异均有统计学意义(P<0.001)。GANT61&N-Shh组与GANT61组相比，Gli1、Gli2、p-AKT、Vimentin和N-cadherin蛋白表达均高于GANT61组，差异均有统计学意义(P<0.001)，见图2。

图2 Western blot法检测食管鳞癌KYSE-30中蛋白表达

A：KYSE-30中的蛋白表达；B：柱状图；a：DMSO组;b：N-Shh组；c：GANT61组；d：GANT61&N-Shh组；与DMSO组比较：*P<0.001；与GANT61组比较：#P<0.001

2.3Transwell侵袭实验结果各组间比较差异有统计学意义(F=519.11，P<0.001)：与DMSO对照组比较，GANT61组穿膜细胞数明显减少(P=0.000)，N-Shh组穿膜细胞数明显增多(P<0.001)，GANT61&N-Shh组穿膜细胞数减少(P<0.001)，GANT61&N-Shh组穿膜细胞数较GANT61组穿膜细胞数增多，差异有统计学意义(P<0.001)，见图3。

图3 Transwell侵袭实验检测各组KYSE-30细胞侵袭能力

a：DMSO组;b：N-Shh组；c：GANT61组；d：GANT61&N-Shh组；与DMSO组比较：*P<0.001；与GANT61组比较：#P<0.001

3 讨论

经典的Hedgehog通路是过度表达的Shh结合跨膜受体Ptch，此过程解除了Ptch对Smo的抑制作用，接下来活化的Smo将信号传递到核转录因子Gli，活化的Gli1和Gli2促进Hedgehog通路下游靶基因的转录，其通路的过度激活可引起细胞过度增殖和促进肿瘤细胞侵袭转移，在前列腺癌中Tong et al[8]已经发现在抑制肿瘤进展过程中抑制Gli家族转录因子比抑制Smo更有效。同时Gli在Hedgehog信号通路中发挥了承上启下的核心作用，因此针对Gli为靶点的治疗可以对Hedgehog通路进行精确的调控[9-10]并能更高效更精准地抑制肿瘤的发生发展，进而为食管鳞癌的靶向治疗提供新的方向。PI3K / AKT / mTOR是研究最多的细胞内信号传导途径之一，并有研究[11]显示在卵巢癌等多种肿瘤中其通路存在异常表达，而磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidvlinositol-3-kinases,PI3K)与其下游丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt相互作用是细胞内重要的信号通路之一，主要参与调节细胞的增殖、分化、转移等多种过程[12-14]。而肿瘤细胞的侵袭转移过程同样受到多种信号传导通路的调节，肿瘤细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被认为是肿瘤浸润和转移最初及重要的一步，其表现为上皮细胞极性及与基底膜连接等上皮表型的缺失和较高的迁移与侵袭的间质表型的增加。N-钙粘蛋白(N-cadherin)位于人体18染色体上，N-cadherin作为EMT的重要标记之一，在许多肿瘤的侵袭转移过程中起着关键作用，在肿瘤的发展过程中N-cadherin功能缺失及N-cadherin功能的获得被认为是EMT的普遍现象，也可作为判断预后的生物学指标[15-16]，Da et al[17]研究发现N-cadherin通过调节相应信号通路及EMT过程促进甲状腺肿瘤发生发展，同时其可能作为甲状腺癌治疗的潜在靶点。波性蛋白(Vimentin)是一种57 ku的III型中间丝蛋白，在小鼠胚胎发育中被发现在前体神经和间充质细胞中，由组织特异性中间丝蛋白逐渐转变形成。波形蛋白是肿瘤生长和转移的预测性生物标志物之一[18]，与多种恶性肿瘤的侵袭转移有密切关系[19]。Li et al[20]研究发现在肺腺癌中Gli高表达时E-钙粘蛋白呈现低表达并且肿瘤的侵袭转移能力增加，说明Gli可能通过作用EMT过程影响肺腺癌的侵袭转移，同时在体外实验中Gli抑制剂阻止了细胞迁移和侵袭并减少肿瘤生长并增加体内E-钙粘蛋白表达，显示了作为治疗肺腺癌靶向药物的前景。但在食管鳞癌中Gli是否通过调控PI3K/AKT通路影响EMT过程而增加细胞的侵袭转移能力至今未有明确报道。

本研究为了阐明Gli、PI3K/AKT与EMT的关系，通过应用特异性Gli1和Gli2靶点的小分子抑制剂GANT61和Shh通路蛋白激活剂N-Shh来观察Gli再被抑制及活化后Vimentin和N-cadherin表达的变化来说明它们之前是否存在联系。结果显示GANT61组明显下调了KYSE-30 细胞的Gli1、Gli2、Vimentin和N-cadherin基因表达以及相应蛋白及p-AKT蛋白的表达，AKT蛋白表达并没有明显变化；而应用N-Shh激活通路后可以明显上调了食管鳞癌细胞KYSE-30相应基因及蛋白的表达，同样AKT蛋白表达并无明显变化。最后再使用GANT61后再用N-Shh激活Hedgehog/ Gli通路，结果显示Gli1、Gli2、Vimentin、N-cadherin基因表达得到部分恢复，同样p-AKT及相应蛋白表达也得到了部分恢复，表明Shh/Gli通路与PI3K /AKT通路之间存在串联关系。Transwell实验也进一步说明Hedgehog/ Gli表达与食管鳞癌细胞的侵袭转移能力密切相关，分析其中的原因可能是在食管鳞癌细胞中Gli通过活化PI3K /AKT信号通路上调了Vimentin和N-cadherin蛋白表达，进而促进了EMT进程，增加了食管鳞癌细胞的侵袭转移能力，而这与Williamson et al[21]和Sun et al[22]分别在研究甲状腺癌细胞发现Hedgehog信号通路通过激活Akt和c-Met通路促进EMT进程和在研究肝癌中通过激活抑癌基因SASH1下调了Shh-Gli1和PI3K-AKT通路进而抑制了肝癌细胞侵袭和转移的结果是相符的。

总而言之，肿瘤细胞的上皮-间质转化进程与多种细胞因子及通路密切相关，本研究目的是初步阐述了在食管鳞癌侵袭转移过程中， Hedgehog/Gli通路的异常活化可能通过调控PI3K/AKT通路来促进上皮-间质转化过程，进而增加食管鳞癌的侵袭转移能力，靶向抑制Gli1和Gli2为食管鳞癌的治疗开辟了新的方向。

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