丰富环境干预对小鼠梨状皮层锥体神经元兴奋性的影响

陈昌锋，陈 磊，江 勤，尹艳艳,2

丰富环境(enriched environment，EE)是多种外环境有益刺激和多信息交流的综合体，与常规环境(standard environment，SE)相比，前者拥有更为宽大的活动场所和多样的生活场景以提供丰富的各类有益刺激，同类动物数量的增加可提供更多的动物之间的信息交流。丰富环境作为一种经典的实验干预方法，主要研究复杂多样的外环境刺激对神经元发育的影响以及对疾病的治疗效果等，已有研究[1]提示丰富环境对老年痴呆、脑卒中和自闭症等动物模型具有一定的治疗效果。丰富环境所产生的良性应激刺激对哺乳类动物大脑的结构和功能有重要影响，外环境的复杂感觉刺激对脑内神经元的生长和发育也至关重要。

小鼠等多数啮齿类动物属夜行动物，主要通过嗅觉和触觉探索周围环境，嗅觉功能在小鼠的整个生命活动中显得尤为重要，梨状皮层是小鼠嗅觉的脑部投射区，小鼠生长发育过程中各种外环境刺激对小鼠梨状皮层的生长和发育都有着重要作用。以往的研究[2-3]主要集中在丰富环境对视皮层和听觉皮层的影响，梨状皮层作为啮齿类动物重要的感觉皮层却鲜有报道，同时锥体神经元是哺乳类动物大脑皮层重要的兴奋性神经元，其电生理特性的变化对梨状皮层的功能可能产生重要影响。该实验运用离体脑片电生理的实验方法，通过全细胞模式记录锥体神经元电生理指标，以期阐明丰富环境干预下，小鼠梨状皮层锥体神经元兴奋性的变化特点。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 实验选用出生后15 d的C57BL/6小鼠30只，雌雄不限，体重(8.0 ± 5)g，随机分成两组：丰富环境组(EE组)和常规环境组(SE组)各15只。

1.1.2药品与试剂 NaH2PO4购自天津大茂化学试剂厂；dextrose购自国药集团化学试剂有限公司；MgSO4、HEPES 和Tris-GTP均购自美国Sigma公司；切脑液(mmol/L)： NaH2PO41.2、HEPES 5、CaCl20.5、NaCl 124、MgSO45、KCl 3、NaHCO426和dextrose 10，pH 7.4；人工脑脊液(灌流液，mmol/L)：NaH2PO41.25、CaCl22、NaHCO426、MgSO42、NaCl 126、dextrose 25、KCl 2.5和HEPES 5，pH 7.4；全细胞记录电极内液(mmol/L)：葡萄糖酸钾 155、EGTA 0.5、Mg-ATP 4、NaCl 4、HEPES 10和Tris-GTP 1，pH 7.35。

1.1.3器材 Axoclamp-200B放大器(美国Axon公司)；震荡切片机(德国Leica公司)，Sutter P-97电极拉制仪和玻璃微电极(美国SUTTER公司)等。

1.2方法

1.2.1不同饲养范式的干预方法 EE组小鼠在丰富环境箱中饲养，丰富环境饲养箱的规格是70 cm×40 cm×35 cm，内部包含管道、小屋、木质玩物以及小鼠筑巢的一些材料如棉花等，除常规垫料外，额外添加一些碎纸、卷纸以及布块等其他一些不同触感的材料。每天固定时间调整饲养箱内各物体的位置一次，每天更换垫料一次，每个箱内饲养小鼠10只。SE组小鼠按照实验室标准饲养环境进行喂养，普通饲养箱，箱内无其他物品，常规垫料，每个箱内饲养4只小鼠。动物房内保持正常的昼夜节律，温度适宜，无杂音干扰。所有小鼠给予充足的水和食物。

1.2.2脑片的制备方法 不同饲养范式干预结束后，取小鼠麻醉，断头取脑，剪开头部皮肤，暴露颅骨，将颅骨沿中间剪开，左右分开颅骨，使脑组织充分暴露，用挖脑勺迅速将小鼠脑组织取出置于冰水混合的切脑液中，切脑液应预先通氧(95% O2+ 5% CO2)。将取下的脑组织稍作修整，用胶水将小鼠脑固定在振荡切片机的平台上，切片机的槽内应预先放入切脑液的冰水混合物，进行冠状切片，切片厚度为350～450 μm，切好的脑片放入充分氧合的人工脑脊液中，25 ℃条件下持续通氧孵育1 h。

1.2.3细胞电生理实验方法 孵育结束后将脑片置于显微镜平台的浴槽内，辅以U形盖网固定，人工脑脊液持续通氧灌流。根据小鼠脑图谱提示的皮层位置关系，在显微镜下找到梨状皮层区。根据锥体神经元的形态呈现锥形这一特点，且与其他神经元相比锥体神经元的顶树突比较容易观察到，同时结合记录到的神经元动作电位发放规律来确定锥体神经元。玻璃电极内充灌电极内液，手指轻弹排空气泡，入液前给予一定正压，以防灌流液中杂质堵塞玻璃电极尖端，利用显微操作系统将玻璃电极尖端贴住神经元，释放正压的同时给予负压吸引，待形成兆欧封接后，用嘴给予负压破膜，利用Axonclamp-200B放大器，在电流钳模式下对梨状皮层锥体神经元进行全细胞纪录，玻璃微电极的入液电阻是5～7 MΩ。实验数据选用的标准是锥体神经元的静息电位负值超过-60 mV且动作电位的振幅超过90 mV。

2 结果

2.1锥体神经元动作电位间距(inter-spikeintervals,ISI)的变化在全细胞记录模式下，通过电极给予细胞一段去极化脉冲刺激，调整该刺激脉冲大小，使其达细胞阈刺激，诱发细胞产生动作电位，动作间距即为阈刺激下相邻动作电位峰值之间的时间间隔，其值的大小表示细胞将兴奋性信号输入转换为编码动作电位的能力的大小。EE组记录的数值分别是ISI1-2～ISI4-5(ms)：(14.28±1.1)、(22.34±2.3)、(28.2±1.73)和(31.83±1.82)，SE组的数值分别是ISI1-2～ISI4-5(ms)：(18.3±1.33)、(28.52±2.67)、(33.83±2.43)和(38.23±2.31)(图1A、B和C)。EE组的动作电位间距与SE组相比均减小,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2锥体神经元能障(energybarrier,Vts-Vr)的变化细胞的兴奋性受阈电位和静息电位的影响。如图1A所示，阈电位(threshold potentials, Vts)是动作电位的起始点，其与静息电位(resting potentials, Vr)之间的差值(Vts-Vr)记为神经元的能障，其含义表示神经元受到兴奋性刺激越过能级障碍产生动作电位的能力。EE组各能障值分别是Vts-Vr1～Vts-Vr5(mV)：(26.52±1.34)、(31.34±1.54)、(32.51±1.2)、(31.73±1.76)和(33.53±1.62)，SE组各能障值分别是Vts-Vr1～Vts-Vr5(mV)：(30.93±1.15)、(36.92±1.98)、(37.3±2.16)、(38.81±1.21)和(38.34±1.33)(图1A、B和D)。EE组与SE组相比能障均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3锥体神经元绝对不应期(absoluterefractoryperiods,ARP)的测定实验通过软件Clampex 10.0连续向神经元输入2个相同的去极化脉冲刺激，通过调整这两个脉冲刺激之间的间隔时间，使第2个脉冲刺激诱导神经元产生动作电位的几率正好是50%，此时产生第2个动作电位的时间点即为第1个动作电位绝对不应期的临界点，定义此时2个脉冲刺激的时间间隔为绝对不应期，其值的大小表示细胞的兴奋程度。图2 A显示的是EE组与SE组锥体神经元的ARP的轨迹图，由图2B得知EE组的ARP要小于EE组，EE组ARP数值是：(3.682 ± 0.583)ms，SE组数值是：(4.45 ± 0.862)ms，两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

丰富环境除了包含了新奇多样的饲养元素，同时为了模拟同类的社交活动在同一环境中还增加了共同饲养的动物数目。丰富环境中所布置的物品会定期进行位置重设和更新，以增加环境新奇性，激发小鼠的探索行为，模拟小鼠的自然生活习性。已有的研究[4-5]显示，丰富环境可促进海马齿状回神经元前体细胞的存活，并增加海马区神经元的数量，早期的丰富环境干预还可增加海马区GABA能神经元的传递效率，促进突触的发育成熟。近来的研究[6]还表明，丰富环境可以促进视觉系统的发育，可见丰富环境刺激在神经回路的形成和功能中起着至关重要的作用，本实验则研究嗅觉系统在早期丰富环境干预下的发育特点。

图1 不同饲养环境对小鼠梨状皮层锥体神经元ISI和Vts-Vr的影响

A：全细胞模式下记录的EE组ISI的轨迹图；B：全细胞模式下记录的SE组ISI的轨迹图；C：ISI的统计图；D：Vts-Vr的统计图；与SE组相比较：*P<0.05

图2 不同饲养环境对小鼠梨状皮层锥体神经元ARP的影响

小鼠嗅觉系统可对来自外环境的上万种不同气味进行识别，这种识别过程主要由分布于嗅黏膜上的气味受体、嗅小球和梨状皮层共同完成，嗅小球将不同的气味信号处理后，传递到更高级的梨状皮层。实验选取了能障、动作电位间距和绝对不应期作为评价梨状皮层锥体神经元内在特性的指标[7-9]。实验中，丰富环境对小鼠梨状皮层锥体神经元电生理特性的影响主要表现在,丰富环境可使锥体神经元的Vts-Vr降低、ISI减小和ARP的缩短。Vts-Vr降低表明锥体神经元在受到去极化刺激后由静息状态到形成动作电位的能力增加，对兴奋性刺激更加敏感，在受到相同去极化刺激下，丰富环境组锥体神经元更容易爆发出动作电位。ISI体现的是在神经元输入一段兴奋性刺激后所爆发出的动作电位的密度，ISI减小表明相同的刺激输入能诱导出更多的动作电位，即动作电位的发放频率增加。ARP的缩短提示神经元在特定的刺激时间内爆发的动作电位数量增加，即动作电位的发放容量增加，这与ISI的减小是相符的，进一步证明了丰富环境组小鼠梨状皮层锥体神经元兴奋性提高。

本实验研究主要集中在锥体神经元的电生理特性的改变，从神经元的角度揭示了丰富环境对梨状皮层的影响，可提高锥体神经元的兴奋性。以往的研究[10]显示丰富环境刺激对小鼠大脑的影响可能是多方面的，其中还包括神经元的树突棘密度及突触形态的改变，甚至一些突触相关蛋白的表达都可能受到影响。本实验选取了小鼠大脑发育的关键时期进行差别化的干预饲养，但前人的研究[11]提示丰富环境对小鼠大脑不同时期可能同样存在影响，这些还有待于后续的进一步研究。

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