一株天然气生物脱硫菌的分离纯化和生物学特性研究

刘其松 孙茹 易铧

1.中国石油西南油气田公司天然气研究院 2.国家能源高含硫气藏开采研发中心 3.中国石油天然气集团公司高含硫气藏开采先导试验基地

在石油化工、冶金和沼气等工业过程中，会产生含H2S的工业废气。H2S为无色有毒气体，对人体健康会造成影响，导致中毒症状，还会严重腐蚀管道设备。因此，含硫废气的脱硫问题越来越受到人们的重视。利用微生物处理废气中的H2S是近年来研究的一种新型处理方法，它具有传统方法无法比拟的优点，如成本低、脱硫率高等[1-4]。参与处理硫化物和H2S的微生物主要有无色硫细菌和光合细菌[5-7]，而目前应用较广的为多种硫杆菌，它们能够氧化硫化物和H2S，生成元素硫，并将硫进一步氧化为硫酸盐。

脱氮硫杆菌是一种兼性好氧菌，在厌氧条件下更容易分离获得纯菌株[8]，而在好氧条件下脱硫更易于操作，成本更低。因此，本研究主要通过厌氧分离获得一株脱氮硫杆菌纯菌种，并对其生理生化特性进行了鉴定。同时，对菌株的生长曲线和最适生长条件进行了研究，旨在为天然气生物脱硫工艺的发展和应用提供参考。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1实验种泥来源

本实验所接种的种泥来自某天然气净化厂污水处理工段的活性淤泥。

1.1.2培养基

厌氧培养基[9]：MnSO40.02 g/L，Na2HPO41.2 g/L，KH2PO41.8 g/L，NaHCO31 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，NH4Cl 0.5 g/L，CaCl20.05 g/L，FeCl30.02 g/L，KNO35g/L，Na2S2O310 g/L，最后调pH值至中性。

好氧培养基：MnSO40.02 g/L，Na2HPO41.2 g/L，KH2PO41.8g/L，NaHCO31 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，NH4Cl 0.5 g/L，CaCl20.05 g/L，FeCl30.02 g/L，Na2S2O310 g/L，最后将pH值调至中性。

1.2 实验方法

1.2.1脱硫微生物的富集培养

从天然气净化厂硫磺回收装置附近被硫磺污染的土壤和污水厂活性淤泥各取5 g，加入装有100 mL无机营养液的厌氧培养瓶中，厌氧培养瓶置于恒温磁力搅拌器上。培养温度35 ℃，搅拌培养20 d。

1.2.2脱硫微生物的定向驯化

将上述培养液加入装有等体积、质量浓度为0.04 g/L NaHS的密闭容器中，静止2 d后，按10%的接种量转入装有无机营养液的培养瓶中，封口。在150 r/min、30 ℃下培养10 d。培养完成后，取出50 mL培养液加入装有等体积、质量浓度为0.08 g/L NaHS的密闭容器中，静止2 d后，按10%的接种量转入装有无机营养液的培养瓶中，封口，在150 r/min、30 ℃下培养10 d。培养完成后，将50 mL 培养液加入装有等体积、质量浓度为0.12 g/L NaHS的密闭耐压容器中，静止2 d后，按10%的接种量转入装有无机营养液的培养瓶中，纱布封口，在150 r/min、30 ℃下培养10 d。

1.2.3脱硫微生物菌落形态鉴定

取上述驯化好的菌液1 mL，用无菌水依次制成体积分数为10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.000 1%的稀释液。然后将体积分数为0.01%、0.001%、0.000 1%的稀释液各0.2 mL，分别接种到平板培养基上，涂抹均匀，倒置于生化培养箱中培养，直至固体培养基表面出现白色圆点状小菌落，此过程需10～14 d。根据脱硫微生物在平板上的生长菌落形态、高倍显微镜下活菌形态以及生化生理的代谢特性，结合《伯杰氏细菌鉴定手则》，初步鉴定获得的脱硫微生物的属种名。

1.2.4菌株的生理生化特性研究

从新鲜斜面上洗下菌落直接接种至装有100 mL初始液体培养基的250 mL摇瓶中，于30 ℃、150 r/min摇床上培养5～7 d，以10%接种量移种至装有100 mL各种考察条件培养基的250 mL摇瓶中，于30 ℃、150 r/min摇床上培养5～7 d。以此摇瓶培养物作为开展培养过程研究的接种物。

利用单因子实验以生物量作为参考指标，研究接种量、培养基初始pH值、培养温度等对微生物脱硫菌种的生长影响，寻找有利于脱硫微生物生长的培养条件。同时，将少量细菌接种到一定体积的新鲜培养基中，经充分培养后，采用比浊法定时测定培养液中的菌量，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，绘出该菌的生长曲线。

2 结果及讨论

2.1 脱硫微生物的富集和驯化

脱硫微生物的筛选是开展天然气生物脱硫研究的首要任务和前提条件。传统筛选菌种均采用平板分离法，由于脱硫微生物一般为化能自养型，在固体平板培养基上生长非常缓慢，在长时间培养过程中，固体培养基水分蒸发过度，致使菌体周围盐度加大，渗透压升高，从而形成的菌落极其微小，见图1。

传统方法是对这些小的菌落逐一验证细菌的转化能力，工作强度较大，筛选效率低。为了克服现有技术的不足，针对天然气生物脱硫的工艺特点，以NaHS浓度作为诱导驯化因子，始终采用液体培养技术，加快了脱硫微生物的生长速度，克服了传统平板培养的脱硫微生物生长缓慢的弊端，快速定向高效的筛选天然气生物脱硫菌群。将通过液体富集后得到的菌悬液进行适当稀释后涂平板培养观察，如图2、图3所示，由于采样地点环境不同，所分离的菌落外观差别较大，说明环境中所含的微生物种类较多。

2.2 富集微生物形态观察和初步鉴定

用竹签挑起以上平板的典型菌落图片观察发现，各个菌落形态差异较大，特别是在淤泥中，由于其环境的多样性，所含微生物种类较复杂，形态较多，如图4所示。本研究应用平板单菌落分离方法，根据细菌形态特征和生理生化特征，先将各菌种鉴定到科，再按各分科检索表鉴定到属。主要的鉴定方法有革兰氏染色试验等。文献[10]报道，在显微镜下观察，硫杆菌菌体大小为0.5～2.5 μm，单个、成对或呈短链状排列，显微镜下可见其细胞内有晶体存在，革兰氏染色呈阴性。平板上菌落外观形状为圆形，外周为白色的菌落。根据分离到的微生物菌落形态生理特点，如图4所示，对照文献[10]，结合《伯杰氏细菌鉴定手则》，初步鉴定目标菌种为硫杆菌属。

2.3 生长特性的研究

2.3.1接种量对脱硫菌种生长的影响

接种量是影响微生物生长繁殖速度的因素之一。采用大的接种量，种子进入新鲜培养基后容易适应，还可以缩短菌体繁殖至高峰所需的时间。但是接种量过大往往使菌体生长过快、过稠，造成营养基质缺乏或溶解氧不足而不利于生长；接种量过小，则会引起前期菌体生长缓慢、生长周期延长、菌体量少等。实验分别考察了接种量为5%、10%、15%和20%对脱硫菌种生长的影响，结果如图5所示。

由图5可知，脱硫菌种的接种量为10%时，OD(optical density,即光密度，以下简称OD)值最高，说明微生物含量最高。当接种量为5%时，菌体生长延缓，细胞含量低；而接种量大于10%时，可能由于菌体过度生长，导致菌体后期营养供量不足，从而降低了脱硫菌种的后期生长。因此，选择10%作为最佳接种量。

2.3.2温度对脱硫菌种生长的影响

由于微生物的生命活动是由一系列生物化学反应组成的，而这些反应受温度的影响极为明显，当微生物处于最适生长温度时，有刺激生长的作用；不适宜的温度可以导致细菌的形态和代谢的改变或使微生物的蛋白质凝固变性而导致死亡。因此，温度是影响脱硫菌种生长、代谢能力和氧化硫化物速率最重要的因素之一。

本实验设计了3个温度梯度：20 ℃、30 ℃和40 ℃。其他实验条件为：初始pH值7，接种量10%，摇床转速150 r/min。实验结果如图6所示。

由图6可知，脱硫菌种在30 ℃时OD值最高，说明微生物生长最好，因此选用30 ℃作为后续试验的培养温度。

2.3.3初始pH值对脱硫菌种生长的影响

不同的微生物要求的最适pH值不同，一般来说，细菌和放线菌要求中性或微碱性的pH值，而酵母和霉菌则在偏酸的环境中生长。当环境中的pH值超过或低于适合其生长的pH值范围时，微生物的生长就会受到抑制。了解这个特性后，就可以配制不同pH值的培养基来培养不同的微生物，或选择性地分离某种微生物。

本实验设计了3个pH值梯度：6.5、7.5和8.5。其他实验条件为初始培养温度30 ℃，接种量10%，摇床转速150 r/min。实验结果如图7所示。

由图7可知，脱硫菌种在pH值为7.5时，OD值最高，说明微生物生长最好，因此，选用pH值为7.5作为培养体系的初始pH值。随着溶液初始pH值由6.5调为8.5，从图7可以看出，溶液细胞量相对减少，由此可以推测，脱硫菌种对高碱性环境的适应能力不太强，在后续研究工作中需提高其碱性耐受性。

2.3.4脱硫菌种生长曲线的绘制

细菌生长曲线的绘制是将少量单细胞微生物接种到一定容积的液体培养基后，在适宜的条件下培养，定时取样测定细胞数量。以细胞增长数目为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制得出一条生长曲线，它反映了单细胞微生物在一定环境条件下在液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。因此，通过测定微生物的生长曲线，可了解菌种的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。

根据实验条件和取样时间，绘制了脱硫菌种生长过程中OD值随时间的变化，如图8所示。从图8中可以看中，菌种各生长周期明显，生长曲线可划分为延缓期0～20 h、对数期20～60 h、稳定期60～80 h和衰亡期。

3 结 论

通过人工构建富集环境，在添加一定浓度硫化物的条件下，将样品环境中的嗜硫微生物进行了体系外的富集。富集完成后，继续采用液体培养基进行诱导驯化，在加快微生物生长速度的同时，逐步提高硫化物浓度，逐级逼近目标微生物。实验过程中得到以下结论：

(1) 根据自然界分离目标菌种的要求，在采样地点的确定上，天然气净化装置已运行几十年，厂区内的土壤及淤泥中自然富集了大量能够适应高硫浓度环境的微生物，因此，在此处采样可以获得优良的脱硫微生物。

(2) 实验表明，连续液体富集和驯化培养技术比固体平板划线分离方法更加适合于自然界中生长缓慢的菌种分离，比如化能自养型细菌。

(3) 从富集和驯化后的平板菌落观察及显微镜下观察发现，样品体系中微生物的形态较多，有单胞状、球形、叠球形、弧形、短杆及长杆状，说明其中微生物种类较多，这些微生物均能在富硫环境中生长，为以后广泛研究嗜硫微生物提供了广阔的野生菌种来源。

参考文献

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