对阴道加德纳菌、白色假丝酵母菌有抑制作用的人阴道乳酸杆菌的筛选和功能

王则绯，谭宏伟

(1 陕西省第四人民医院，西安710043；2 西北妇女儿童医院)

健康女性阴道是一个复杂的微生态环境，定植着益生菌和条件致病菌[1]。乳酸杆菌在健康女性阴道中占有绝对优势，黏附于阴道上皮细胞，通过竞争排斥和产生抗菌物质等抑制病原菌生长[2]。但是在某些因素，如雌激素水平降低、不洁性行为、抗生素滥用等作用下，阴道微生态平衡被破坏，导致一些条件致病菌过度生长，引起阴道疾病，如细菌性阴道病(BV)和外阴阴道念珠菌病(VVC)等[3～5]。研究显示，阴道加德纳菌(Gv)和白色假丝酵母菌(Ca)分别是BV和VVC的主要致病菌，因此常将其作为指示菌[6，7]。尽管近十年来国内外日益重视益生菌的研究和开发，但是关于乳酸杆菌抑制细菌生长的机理仍有待进一步研究。国内部分研究显示了乳酸杆菌在体内和体外的抗菌效果[8]，但是迄今为止，我国上市的阴道乳酸杆菌活菌制剂仅有德氏乳杆菌DM8909(商品名：定君生)一种，因此有必要继续开发有利于预防和治疗女性泌尿生殖道感染的乳酸杆菌制剂。本研究首先从本地健康妇女阴道分泌物中筛选出抑Gv/Ca效果明显的8株乳酸杆菌，然后观察其产生过氧化氢的能力、产生乳酸的能力、自聚合/共聚合能力以及产生生物膜的能力。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 阴道分泌物标本取自2017年1～6月在我院门诊接受孕前检查的女性。排除标准：①处于月经期；②1个月内使用抗生素或者抗真菌药物者；③1个月内口服或者外用避孕药者；④48 h内曾经阴道用药或者阴道冲洗者；⑤半年内曾经被诊断过妇科或者泌尿系统炎症性疾病者；⑥妇科检查发现阳性体征者。符合上述标准的女性留取阴道后穹窿分泌物，行相关检查除外细菌性阴道病、滴虫性阴道炎、外阴阴道念珠菌病和性病、梅毒患者。共30例妇女纳入本研究，入组者年龄18～30岁。取入组者阴道后穹窿分泌物标本进行后续实验。本研究已获得医院医学伦理委员会批准，入组者均签署知情同意书。

1.2 具有抑Gv/Ca菌活性的人阴道乳酸杆菌的筛选

1.2.1 人阴道乳酸杆菌菌株的分离和纯化 将符合标准的健康女性阴道分泌物接种于MRS培养基中，置于厌氧培养箱中37℃厌氧培养(85 % N2、10 % H2和5 % CO2)48 h。挑选疑似乳酸杆菌菌落进行革兰染色，疑似乳酸杆菌菌落具有如下特征：革兰染色阳性，无芽孢，呈杆状或球杆状，单个、成对或者栅栏状排列，无动力；白色或乳白色菌落，呈圆形、扁平或者隆起、边缘整齐、不透明；硝酸盐还原实验和触酶实验阴性，吲哚阴性，不液化明胶。用平板划线法进行分离培养。经过3～4个增菌-平板分离-再增菌-再平板分离的循环后得到纯菌种。

1.2.2 获得乳酸菌株分型 采用16S rDNA基因测序法将乳酸杆菌在MRS培养基中复苏并活化培养3代，用试剂盒法提取其基因组。以细菌16S rRNA基因高保守区为靶点, 所选寡聚核苷酸引物为SAdir：5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′和S17rev：5′-GTTACCTTGTTACGACTT-3′，对该引物扩增出16S rRNA序列片段。扩增体系体积50 μL，含有200 μmol/L的dNTP，上下游引物各2 μmol/L，100 ng模板DNA， 2.5 U Taq DNA聚合酶，5 μL 10×PCR缓冲液 。PCR反应条件为：94 ℃孵育 3 min，然后 94 ℃ 60 s、50 ℃ 90 s、72 ℃ 2 min共30个循环，72 ℃终延伸6 min。PCR产物行0.8 %(w/v)琼脂糖/TAE凝胶电泳，阳性者送北京华大基因公司进行双向测序。用 BLAST程序进行NCBI位点分析，测序结果与GenBank中的序列相比较，寻找与目的基因序列同源性最高的已知分类菌种，从而确定菌株类型。

1.2.3 获得乳酸杆菌菌株对指示菌的抑菌活性检测 采用双层琼脂扩散法评价筛选出的乳酸杆菌对指示菌(10种细菌和5种假丝酵母菌)的抑菌效果。各指示菌(细菌和假丝酵母菌)的培养条件如下：阴道加德纳菌、羞怯动弯杆菌和中间普雷沃菌培养选择布氏肉汤，包含1%蛋白胨5号、0.2% Tween 80，0.3 %肉浸液、0.5 %血晶素、0.1 %维生素K和3 %马血清。脆弱拟杆菌和普通拟杆菌培养选择脑心浸液肉汤(BHI肉汤)，包含0.5 %血晶素和0.1 %维生素K。在37 ℃厌氧培养箱中培养18～24 h。无乳链球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌和金黄色葡萄球菌培养选择BHI肉汤,在37 ℃厌氧培养箱中培养18～20 h。白色假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克鲁斯氏假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌培养选择沙氏葡萄糖肉汤。在37 ℃厌氧培养箱中培养18～20 h。将乳酸杆菌(浓度109CFU/mL)接种于MRS固体培养基表面特定位置，于37 ℃厌氧培养箱中过夜培养。加入指示菌(细菌浓度109CFU/mL、假丝酵母菌浓度107CFU/mL)菌液的特定培养基混合液，通过无菌移液管至已接入乳酸杆菌的平皿中，在37 ℃厌氧培养箱中培养24 h，观察有无抑菌圈并测量抑菌圈直径，从而筛选出对Gv/Ca有抑菌活性的乳酸杆菌。

1.3 有抑Gv/Ca菌活性的人阴道乳酸杆菌功能的观察

1.3.1 对Gv/Ca抑菌活性的定量观察 取筛选出的乳酸杆菌培养悬浮液或上清液与Gv或Ca进行共孵育实验。所筛选乳酸杆菌菌株、Gv和Ca离心后，用无菌PBS洗涤3次后，重悬于各自新鲜肉汤中，使浓度分别达到：乳酸杆菌108CFU/ mL或106CFU/mL、Gv 108CFU/ mL、Ca 106CFU/mL。乳酸杆菌培养上清液用0.22 μm滤膜过滤除菌后4 ℃保存备用。取2 mL的乳酸杆菌悬浮液或者上清液，与等体积等浓度的Gv或者Ca在37 ℃厌氧培养箱中共孵育18 h。将乳酸杆菌、Gv或Ca培养液作10倍梯度稀释并分别涂布MRS、Vaginalis琼脂或沙氏葡萄糖琼脂(SDA)上。阳性对照为等量Gv或Ca用等量新鲜MRS培养基孵育。

1.3.2 产过氧化氢(H2O2)能力观察 将筛选出的乳酸杆菌浓度调定为109CFU/ mL。将0.5 mL菌液接种到含0.25 mg/mL TMB和0.01 mg/mL HRP的3 mL MRS肉汤中，在37 ℃厌氧培养箱中培养24 h，然后常氧培养30 min。采用Edema等[10]所描述的方法进行定量分析。以嗜酸乳酸杆菌ATCC 4356作为阳性对照，培养基本身作为阴性对照。

1.3.3 产乳酸能力观察 筛选出的乳酸杆菌菌液按1%比例接种于新鲜MRS培养基中，在37 ℃厌氧培养箱中培养48 h。经离心测定上清液pH值。通过酸碱滴定法测量乳酸杆菌乳酸的产生量，方法如Edema MO[10]所述。以嗜酸乳酸杆菌ATCC 4356为阳性对照，培养基本身作为阴性对照。

1.3.4 自聚合和共聚合能力观察 参考Kos等[11]的方法。所筛选乳酸杆菌菌株、Gv和Ca离心后，用无菌PBS洗涤3次后，重悬于各自新鲜肉汤中，使浓度分别达到：乳酸杆菌109CFU/ mL或107CFU/mL、Gv 109CFU/ mL和Ca 107CFU/mL。4 mL细胞悬液(自聚合)或者乳酸杆菌和Gv各2 mL的混合悬液(共聚合)或者乳酸杆菌和Ca各2 mL的混合悬液(共聚合)，经蜗旋10 s后，放置在室温下孵育5 h。分别在0 h和5 h取样测量其在 600 nm下的吸光度A值，分别记为A0和A5。自聚合能力(%)= [ 1-(A5/A0)]×100%。共聚合能力(%)=2{[(Ax+Ay)/2]-A(x+y)}/(Ax+Ay)×100%。其中，Ax和Ay分别为单个微生物的吸光度，A(x+y)是指乳酸杆菌与Gv或Ca混合微生物的吸光度。共聚合定性实验500 μL乳酸杆菌与500 μL Gv或Ca混合，短暂蜗旋后，室温下以50 r/min振荡2 h。上清液进行革兰染色，显微镜下观察。存在大而浓厚的微生物丛定义为++，小而稀疏分散的微生物丛定义为+，无微生物丛定义为-。

1.3.5 生物膜形成能力观察 参考Pérez-Ibarreche等[12]方法。乳酸杆菌菌株(109CFU /mL)用新鲜MRS按5% v/v稀释后取200 μL加入无菌96孔平底细胞培养板中，每株接种4孔，设置空白对照(同体积无菌MRS)。在37 ℃厌氧培养箱中培养72 h。PBS洗板3次，将未黏附的乳酸杆菌洗去。晾干后，每孔加入200 μL的0.1 %结晶紫(w/v)染色30 min，去离子水冲洗未黏附的乳酸杆菌。晾干后每孔加入200 μL异丙醇-甲醇-PBS溶液(1∶1∶18)，轻微振荡。去离子水冲洗2次，祛除过度染色。在酶标仪下读取每孔570 nm处的吸光度值(OD)。以阴性对照孔的A值(ODc)作为参考，计算OD/Odc≤1为无生物膜形成能力，1～2为生物膜形成能力弱，2～4为生物膜形成能力中，4～8为生物膜形成能力强，>8为生物膜形成能力极强。

2 结果

2.1 有抑Gv/Ca菌活性的人阴道乳酸杆菌的筛选经过及结果 30名健康女性阴道分泌物中分离出51株菌，其中23株具有乳酸杆菌特征。对23个乳酸杆菌进行16S rDNA基因测序，确定其中9个菌株为卷曲乳酸杆菌、7个菌株为植物乳酸杆菌、6个菌株为发酵乳酸杆菌、1个菌株为加氏乳酸杆菌。双层琼脂扩散实验结果显示，共有8个菌株对Gv和/或Ca有抑菌作用：包括仅抑制Gv的2号菌株、仅抑制Ca的7、26和44号菌株以及对同时抑制二者的16、19、31和41号菌株。上述8个菌株即为筛选出的有抑Gv/Ca菌活性的人阴道乳酸杆菌，其拮抗Gv、Ca的平均抑菌圈直径分别为18.94 、13.97 mm。

2.2 筛选出的有抑Gv/Ca菌活性人阴道乳酸杆菌的功能

2.2.1 对Gv/Ca抑菌活性 2、7、16、31、41号菌株共培养、上清液培养对Gv的抑菌活性见表1。7、16、19、26、31、41、44号菌株共培养、上清液培养对Ca的抑菌活性见表2。筛选出的8种乳酸杆菌与Gv共培养时，全部菌株均显示了抑菌活性，其中41号菌株完全抑制了Gv的生长；当用乳酸杆菌培养上清液孵育Gv时，全部菌株培养上清液均显示了明显地抑菌活性。当乳酸杆菌与Ca共培养时，全部菌株均显示了抑菌活性；当乳酸杆菌培养上清液孵育Ca时，全部菌株培养上清液均显示了抑菌活性，其中19号菌株完全抑制了Ca的生长。

2.2.2 产生H2O2、乳酸能力 各菌株pH值、乳酸生成量和H2O2生成量见表3。8个乳酸杆菌菌株pH值、乳酸生成量 和H2O2生成量与阴性对照菌株相比，P均<0.05。其中以19号和41号菌株的产酸和产H2O2能力最强，达到了阳性对照菌株水平(P均>0.05)。

表1 2、7、16、31、41号菌株共培养和上清液培养对Gv的抑菌活性

注：与阴性对照菌株相比，*P<0.05。

表2 7、16、19、26、31、41、44号菌株共培养和上清液培养对Ca的抑菌活性

注：与阴性对照菌株相比，*P<0.05。

表3 乳酸杆菌菌株培养上清液中pH值、乳酸和H2O2水平

注：与阳性对照菌株相比较，*P<0.05；与阳性对照菌株相比较，#P>0.05。

2.3 自聚合/共聚合水平 Gv的自聚合水平为45.25 %，而Ca的自聚合水平则高达100 %。乳酸杆菌菌株16号(92.57 %)、19号(96.32 %)、31号(92.16 %)和41号(93.52 %)均显示了明显的自聚合能力。19号、26号和41号菌株显示了与Ca较强的共聚合能力(定性均为++，定量分别为61.23 %、58.72 %和54.59 %)，其他菌株与Ca的共聚合水平为28.53 % ～ 44.21 %。16号、19号和41号菌株显示了与Gv较强的共聚合能力(定性均为++，定量分别为82.34 %、83.41 %和93.56 %)，其他菌株与Ca的共聚合水平为41.33%～46.12%。

2.4 细菌生物膜形成情况 筛选出的8种乳酸杆菌均能够形成生物膜，其中19号菌株最强，其次是41号菌株。

3 讨论

据统计，全球每年大约有10亿女性患泌尿生殖道感染，目前的主要治疗方法是抗生素。但是抗生素的长期使用往往导致阴道微生态失衡，疗效不佳，且易复发。利用微生态疗法选择乳酸杆菌来恢复阴道菌群失调和预防感染，是一种安全而有效的手段[13]。目前我国上市的阴道乳杆菌活菌制剂仅有德氏乳杆菌DM 8909(商品名：定君生)一种，因此有必要继续开发有利于预防和治疗女性泌尿生殖道感染的乳酸杆菌制剂。

本研究从健康妇女阴道后穹窿分泌物中分离出的23株乳酸杆菌中包括9个卷曲乳酸杆菌、7个植物乳酸杆菌、6个发酵乳酸杆菌和1个加氏乳酸杆菌菌株。Gv是BV最常见的致病菌[6]，Ca是VVC和复发性VVC的主要致病菌[7]，故我们进一步筛选出对Gv和Ca具有较好抗菌活性的8株乳酸杆菌，并通过乳酸杆菌培养悬浮液和上清液与Gv或Ca共孵育的方法，进一步证实了它们较强的抗菌活性。

乳酸杆菌产生H2O2是防止病原微生物或机会致病微生物定植的一个重要机制[14]。在阴道分泌物中，H2O2转变为ROS，例如超氧阴离子、羟基自由基，它们对许多微生物(如Gv、Ca和淋球菌等)和病毒颗粒(如人类免疫缺陷病毒-1等)具有高度毒性[15]。乳酸杆菌生成H2O2减少与BV、复发性尿路感染和人类免疫缺陷病毒-1敏感性增加明显相关。乳酸杆菌有机酸的生成对于维持阴道pH值<4.5是至关重要的。本研究也显示筛选的8个乳酸杆菌菌株良好的产生乳酸和H2O2能力，并且可以保持培养液较低的pH值，这些结果与先前报道的阴道乳酸杆菌可以作为益生菌的内容相一致。

生物膜是一种原核生物多细胞聚合形式，是在不利条件下细菌维持生存所形成的一种特殊结构。与单个细菌分散的浮游形式不同，它附着在非生物或生物活性表面，由自身产生的多聚基质包裹细胞群落。自聚合是指相同遗传背景的细菌发生相互聚集，共聚合是指悬浮液中不同遗传背景的细菌相互黏合在一起。对于致病菌来说，生物膜具有保护细菌、促进细菌逃避机体免疫和对抗抗菌药物的作用。但是对于乳酸杆菌来说，生物膜形成和自聚合能力或许会产生有益效果，例如可能会增加乳酸杆菌在阴道上皮细胞的自身定植。本研究所筛选出的乳酸杆菌菌株均具有不同程度的自聚合和生物膜形成能力，其中19号和41号菌株的形成能力甚至达到了极强和强的标准。本研究也显示了筛选出的乳酸杆菌与Gv和Ca有共聚合能力，这也是其防止病原菌黏附的一个重要机制。

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