紫草素对宫颈癌细胞株Caski增殖、凋亡及HPV E6-E7 mRNA表达的影响

舒海燕，柯丽娜，陈富超，李斌

(湖北医药学院附属东风医院，湖北十堰 442008)

宫颈癌主要与人乳头瘤病毒(HPV)的致病性密切相关[1]。HPV是一种结构简单的DNA病毒，其中的E6和E7基因已被证实是癌基因[2]。E6、E7基因产生的蛋白分别可与抑癌性的p53和pRB蛋白结合,导致p53和pRB蛋白失活，破坏细胞的正常周期，最终导致癌变[3]。E6、E7基因是宫颈癌抗肿瘤治疗的重要靶点。紫草素是从药用紫草的根部提取的萘醌类化合物，具有多种生物学活性[4]，其抗肿瘤作用已得到业界的广泛认可[5～7]。在宫颈癌方面，有相关文献也已报道紫草素可诱导宫颈癌Hela细胞凋亡[8～10]，但都是从三大经典凋亡通路方面进行研究，而关于紫草素能否通过降低HPV E6、E7基因的表达来达到治疗宫颈癌目的的相关研究国内外未见报道。本研究观察了紫草素对人宫颈癌细胞株Caski增殖、凋亡及HPV E6、E7 mRNA表达的影响，旨在从抗病毒癌基因表达方面研究紫草素的抗宫颈癌作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂和仪器 人宫颈癌细胞株Caski购自中国典型培养物保藏中心，贴壁培养于10%胎牛血清的RPMI1640高糖培养基中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每2～3 d传代1次，取对数生长期细胞进行后续实验。紫草素(Calbiochem公司，纯度≥98%)，RPMI 1640 细胞培养基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，MTT粉剂(Sigma公司) ，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(Antgene公司) ，4′,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司),一步法核酸提取试剂盒(Hybribio公司)，逆转录试剂(美国Fermentas公司)，PCR引物(上海生工生物有限公司设计并合成)，First Strand cDNA Synthesis Kit (TOYOBO公司)，SYBR Green Real-Time PCR Master Mix(TOYOBO公司)。 Synergy型全自动酶标板分析仪(Bio-Tek公司)，Molecular Imager ChemiDoc XRS + Image Lab 2. 0型成像系统(Bio-Rad公司) ，倒置相差显微镜，FACS Calibur型流式细胞测定仪(Becton-Dickinson 公司)， BX51型正置荧光显微镜(Olympus公司)，医用核酸分子杂交仪(Hybribio公司)，荧光定量PCR仪Rotor Gene-6000 (Rotor Gene公司)。

1.2 不同浓度紫草素处理的Caski细胞增殖情况观察 取对数生长期Caski细胞，制成1×104/mL的细胞悬液，每孔200 μL接种于96孔板，设1～6组，每组6孔，次日分别加入含0、5、10、20、40、80 μmol/L紫草素的RPMI1640培养液，继续培养12、24、36 h后，采用MTT法观察各组细胞增殖情况(以OD490表示)。

1.3 不同浓度紫草素处理的Caski细胞凋亡率测算 取对数生长期Caski细胞，制成1×104/mL的细胞悬液，每孔200 μL接种于96孔板，设A～E组，每组6孔，次日分别加入含0、5、10、20、40 μmol/L紫草素的RPMI1640培养液，继续培养24 h后，收集上清液，用PBS清洗后收集清洗液，再用胰酶消化收集贴壁细胞，要求细胞总数达1×106个，离心后弃上清，PBS清洗一遍，再用500 μL结合缓冲液重悬细胞转移至流式细胞管，每管中分别加入5 μL Annexin V-FITC染色10 min后再加入10 μL PI 染色10min，用流式细胞仪测算各组细胞凋亡率。

1.4 不同浓度紫草素处理的Caski细胞HPV E6、E7 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR法。细胞分组及处理同1.3。培养24 h后提取各组细胞RNA，逆转录合成cDNA，然后行实时荧光定量PCR扩增。E6上游引物5′-CTGCAATGTTTCAGGACCCA -3′，E6下游引物5′-TCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT -3′，E7 上游 引物5′-GAGGAGGAGGATGAAATAGATGGT -3′，E7下游引物5′-CACTTGCAACAAAACGTTACAATATTG -3′，GAPDH上游引物5′-CTTTGACGCTGGGGCTGGCA -3′，下游引物5′-TGGCAGGGACTCCCCAGCAG -3′。PCR反应条件为50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15s、60 ℃ 30 s共40个循环。采用2-△△CT表示E6、E7 mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 各组Caski细胞OD490比较 相同培养时间比较1～6组Caski细胞OD490随紫草素剂量提高逐渐下降(P均<0.05)。

表1 培养12、24、36 h时1～6组Caski细胞OD490比较

2.2 各组Caski细胞凋亡率比较 培养24 h后A、B、C、D、E组细胞凋亡率分别为3.9%±0.2%、9.1%±0.3%、28.9%±0.5%、41.7%±1.2%、88.1%±1.3%、97.17%±0.7%。A～E组Caski细胞凋亡率随紫草素应用剂量提高逐渐升高(P均<0.05)。

2.3 各组Caski细胞HPV E6、E7mRNA相对表达量比较 培养24 h后各组Caski细胞HPV E6、E7 mRNA相对表达量见表2。培养24 h后A～E组Caski细胞HPV E6、E7 mRNA相对表达量随紫草素应用剂量提高逐渐升高(P均<0.05)。

表2 各组Caski细胞HPV E6、E7 mRNA相对表达量比较

3 讨论

作为妇科最常见恶性肿瘤之一，宫颈癌已对女性的健康构成极大威胁。目前临床上治疗方式主要有手术、放疗和化疗。晚期宫颈癌患者适合全身性综合治疗[11]，化疗是全身性综合治疗中的首选方案，尽管迄今为止宫颈癌化疗药物已取得一定的成绩，但明确有效的化疗药仍有限，且价格昂贵，耐药性也越来越大[12]，因此新药的研发迫在眉睫。

HPV感染是宫颈癌发病最主要的原因，其致病机理主要与其致癌基因E6、E7通过直接或间接的方式干扰细胞周期、抑制细胞凋亡，从而促使细胞永生化有关。研究发现多种药物通过影响病毒癌基因的复制、转录、翻译来达到诱导肿瘤细胞凋亡的目的[13]，证实E6、E7是肿瘤治疗的重要分子靶点。

细胞凋亡是细胞程序性死亡中独特的细胞死亡方式，在多种内源性基因调控下，细胞产生的生理或自然死亡过程是细胞凋亡[14～16]。细胞凋亡在维护机体生理稳态、应答DNA损伤、抑制细胞增殖等方面起着重要的作用，也是目前生命科学研究中的热门内容。目前，细胞凋亡与肿瘤的治疗有极大的相关性，抗肿瘤药物的研发主要集中在诱导肿瘤细胞凋亡的层面上[17～20]。紫草素作为近年来新发现的萘醌类化合物，已被证实可从多种途径抑制多种癌细胞的凋亡[21]。

本研究结果显示紫草素可抑制宫颈癌Caski细胞的增殖并诱导其凋亡，进一步研究发现紫草素作用宫颈癌Caski细胞后，HPV E6、E7 mRNA表达量下降，提示紫草素诱导宫颈癌Caski细胞凋亡的机制可能与降低E6、E7基因的表达有关。

HPV感染的治疗是现代医学的一个难题。紫草素作为传统中药的活性成分，在抗菌、抗肿瘤等方面的研究也取得了一定的成果。本研究首次发现紫草素能诱导宫颈癌Caski细胞凋亡，其机制可能与降低E6、E7基因的表达有关，表明了紫草素在抗HPV相关宫颈癌的优势，而关于紫草素能否诱导HPV感染的正常细胞和癌前病变细胞凋亡以及降低相关细胞E6、E7基因的表达来发挥抗病毒、抗肿瘤的作用，以早期治疗HPV感染并预防宫颈癌的发生发展，仍需进一步研究。

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