固相萃取-紫外可见分光光度比色法测定金花茶中总皂苷含量

曾永明 陈松武 栾洁 周丽珠 蒙芳慧 罗玉芬 韦晓娟 廖仲秋

【摘 要】金花茶叶、花中的总皂甙测定方法尚无国家标准。采用VM24固相萃取提取装置具有洗脱液流速恒定可控、可批量处理，保证试验系统的密闭性等优点，可保证结果的平行性和准确性。用CNWBOND Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge固相萃取小柱、对总皂苷测定前处理过程进行了优化，整套方法简单，数据结果离散性小，平行性得到提高。人参皂苷Re含量（mg）的回归方程为y=8.149 9x+0.234 1，R2=0.999 1，结果表明，总皂苷（以人參皂苷Re计）在0.000 0～0.114 2 mg范围内线性关系良好。

【关键词】金花茶;总皂甙;固相萃取;紫外分光光度法

【中图分类号】R284.1 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2018）12-0073-02

金花茶[Camellia chrysanth（Hu）Tuyama]系山茶科（Theaceae）、山茶属（Camellia）、金花茶组（set.Chrysantha）植物，是中国特产的传统名茶，也是世界性的名贵观赏植物。金花茶化学成份复杂，其主要活性物质有皂甙、黄酮、茶多酚、茶多糖等，研究证实金花茶中物质具有降低血清中胆固醇、提高机体免疫能力、抑制肿瘤生长、降血脂、降血糖等多种生理功能。总皂甙是金花茶叶、花的主要活性成分之一，目前金花茶叶、花中的总皂甙测定方法尚无国家标准，大多都是按照《保健食品检验与评价技术规范 （2003年版）》“保健食品中总皂甙的测定”方法检测，本文主要研究金花茶叶、花总皂甙含量的固相萃取-紫外可见分光光度比色法测定方法，并以相对标准偏差、稳定性、加标回收率为指标进行方法验证，取得了可靠的试验结果。

1 实验目的

目前金花茶叶、花中的总皂甙测定方法尚无国家标准，大多都是按照《保健食品检验与评价技术规范（2003年版）》“保健食品中总皂甙的测定”方法检测。该方法采用人参皂苷Re为对照，用香草醛比色法测定总皂苷，其显色体系为香草醛-冰醋酸-高氯酸。但在实际操作和相关文献报道中，采用该方法检测的结果误差较大，尤其是不同实验室间测定结果差异更大，不利于产品的质量控制。

本实验采用VM24固相萃取提取装置具有洗脱液流速恒定可控、可批量处理、保证实验系统的密闭性等优点，可保证结果的平行性和准确性。用CNWBOND Alumina-N/XAD-

2 SPE Cartridge固相萃取小柱（规格0.8 g/2.7 g，6 mL）、对总皂苷测定前处理过程进行了优化，整套方法简单，数据结果离散性小，平行性得到提高。

2 实验方法

2.1 标准溶液制备

精密称取5.71 mg人参皂苷Re对照品置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。吸取10 mL人参皂苷Re标准溶液（0.228 4 mg/mL）放蒸发皿中，水浴（低于60 ℃）挥干，准确加入10 mL水溶解，作为标准溶液。

2.2 样品溶液制备

精密称取适量样品，置于50 mL离心管中，加水适量溶解，超声30 min，放置至室温，用水稀释至刻度，摇匀，

3 500 r/min离心5 min，0.45μm微孔滤膜过滤。

2.3 样品溶液吸附及洗脱

取样品溶液上清液置于收集管中（大于2 mL），放置于VM24固相萃取系统中，按以下步骤进行吸附及洗脱。

（1）活化：在固相萃取柱中，以2.5 mL/min流速冲洗70%乙醇25 mL，然后以2.5 mL/min流速冲洗水25 mL。

（2）上样：以1 mL/min流速加1 mL样品溶液于固相萃取柱中。

（3）洗脱：以0.8 mL/min流速，依次用25 mL水，25 mL70%乙醇进行洗脱，收集70%乙醇洗脱液。

（4）挥干：将收集的洗脱液转入50 mL的刻度试管中，在60 ℃下氮气吹干。

2.4 显色与测定

在上述已挥干的洗脱液中准确加入0.2 mL5%香草醛冰乙酸溶液，使残渣全部溶解，再加0.8 mL高氯酸，混匀后60 ℃水浴上加热10 min，冰浴冷却后，准确加入冰乙酸5.0 mL，摇匀后，以1 cm比色管于540 nm波长处与标准管一起进行比色测定。实验方案见表1。

3 实验数据

样品含量测定：分别取金花茶叶、花，进行测定，于540 nm波长处测定吸光度值，根据所得到的标准曲线计算样品中总皂苷的含量。实验数据见表2。

4 结果分析及讨论

线性关系考察：精密吸取前述“2.1”项标准溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL人参皂苷Re标准溶液（0.228 4 mg/mL），按“2.3”“2.4”项的方法进行前处理并测定。以吸光度值为横坐标，以人参皂苷Re含量（mg）为纵坐标进行回归计算，回归方程为y=8.149 9x+0.234 1，R2=0.999 1，结果表明，总皂苷（以人参皂苷Re计）在0.000 0～0.114 2 mg范围内线性关系良好，图1为线性关系图。

加样回收率试验：采用加标回收率法，精密称取金花茶花适量，分别按样品量100%的比例各6份加入对照品，进行测定，并分别计算回收率，结果加标回收率在99.58%～100.05%，RSD0.18%，并与传统方法（手填层析柱、人工进行柱洗脱）进行比较，表明该方法准确度良好，且离散度低于传统方法。加样回收率试验结果见表3。凹脉金花茶花加标回收率试验结果见表4。

5 稳定性试验

将显色后样品分别放置0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，测定吸光值，结果表明该显色体系在1 h内吸光度基本不变，1 h后吸光度有所降低，故在显色后1 h内测定。

6 讨论

（1）《保健食品检验与评价技术规范（2003年版）》中，保健食品总皂苷的测定，样品采用过大孔吸附树脂，再加显色剂显色后测定吸收值。操作过程中，在柱层析时，树脂活化的时间长短以及样品在过柱时，洗脱速度快慢不一，使得测定的总皂苷结果誤差较大，无法确保检测结果稳定。采用VM24固相萃取提取装置具有洗脱液流速恒定可控、树脂活化时间适当延长，可大批量处理样品，保证实验系统的密闭性等优点，可保证结果的平行性和准确性。

（2）不同厂家的大孔树脂、填料松紧和载药量也对总皂苷测定影响较大，选择CNWBOND Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge固相萃取小柱，简化实验前处理过程，数据结果离散性小，平行性得到提高。

（3）本实验分析的金花茶有叶和花，在上柱前的样品需经离心，并经微孔滤膜过滤，保证不阻塞固相萃取提取仪进样系统。

（4）对于总皂苷的测定实验，柱层析是关键步骤，而柱层析的关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。传统手装的柱子很难保证填料的质量相同、松紧一致，在洗脱过程中可能会出现气泡，柱子塌陷等现象，进而导致提取效果不佳，测定的数据重复性差。CNWBOND Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge固相萃取小柱将所需的填料质量细化，并且采用了砂芯隔板，使填料的松紧一致，而且顶端的砂芯隔板使层析面平整，在洗脱时防止了柱子内部质量不均现象出现，优化了本实验的前处理方案。采用SPE小柱进行多次试验，发现试验的数据重复性明显优于传统实验方案。将CNWBOND Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge固相萃取小柱与VM24固相萃取仪相结合，也实现了多批样品的同时测定，减轻实验室工作量。

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