三嗪-罗丹明荧光探针的合成及水中铜离子检测研究

吕永军， 安荣华， 黄 超， 魏 薇

(四川理工学院化学工程学院， 四川 自贡 643000)

引 言

铜是生命体中的微量矿物元素之一，铜离子含量的高低与大量酶催化过程和贫血、冠心病、不孕症等疾病都密切相关。在环境中，过量的铜矿开采和冶炼，导致大气、土壤和水体铜污染，通过生物链富集危害人体健康[1-3]。

目前，铜离子的测定方法主要有荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、电化学法、原子吸收、原子发射等[4-6]方法。其中，荧光分光光度法具有选择性好、灵敏度高、操作简便等优点，近年来备受研究者关注。针对铜离子的荧光识别检测，已有较多报道[7-8]。由于Cu2+具有顺磁性结构，极易导致荧光猝灭，为荧光探针分子的设计和识别检测带来挑战[9]。开发灵敏度高和选择性好的荧光增强型铜离子探针分子具有十分重要的研究意义。

罗丹明是一种氧杂蒽类荧光色素，具有量子产率高、抗酸碱、发射波长位于可见光区等优势，广泛用于金属离子荧光探针设计。罗丹明衍生物闭环状态下无荧光，开环后荧光增强，发射红色荧光信号，是优良的荧光增强型金属离子识别和检测的信号报告单元[10]。因此，基于罗丹明化合物的金属离子探针被广泛报道。目前基于罗丹明衍生物的Cu2+荧光探针分子结构中一般引入含氮、含氧、含硫等配体基团，改善其识别检测的选择性和灵敏度。Wu等[11]合成了含硫脲单元的罗丹明荧光探针对Cu2+表现出较强的选择性和灵敏度，最低检测限可达4.72×10-8mol/L。Thennarasu等[12]报道的双罗丹明单元的Cu2+探针比单个罗丹明单元探针的灵敏度增高近一倍。Tao等[13]合成了三足席夫碱类罗丹明探针对Cu2+的检测限为1.13×10-7mol/L，荧光显著增强。对比可知，增加罗丹明络合单元，检测限降低，结合作用增强，Cu2+识别检测的灵敏度明显提升，这是当前探针分子研究的主要发展方向和趋势。综述报道的罗丹明荧光探针大多识别研究体系为有机体系[14]，而用于实际样品中的金属铜离子检测方面的研究较少报道[15-19]。

本文设计合成一种新型结构的罗丹明化合物TR1，依靠三嗪结构共价连接三个罗丹明单元，用于提高探针分子对金属离子检测的灵敏度，合成路线如图1所示。采用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱等方法，考察了TR1对Cu2+的识别性能，并用于水样中Cu2+检测。

1 实验部分

1.1 实验仪器和试剂

Lambda35型紫外-可见分光光度计(美国Perkin Elmer公司)；LS-55型荧光分光光度计(美国Perkin Elmer公司)；AVANCE-400型核磁共振仪(德国Bruker公司)；ZQ-4000型质谱仪(美国Waters公司)；CP213电子天平(美国奥豪斯公司)；DF-1磁力搅拌器(上海力辰科技公司)。

图1 TR1探针分子的合成路线

金属离子标准溶液：准确称取一定量的金属氯化盐(Na+、K+、Al3+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Fe3+、Hg2+、Zn2+、Ba2+、Pb2+)，配成浓度为5.0×10-2mol/L的贮备液，使用时适当稀释。所用实验药品均为市售分析纯，实验室用水为超纯水。

TR1标准溶液：准确称取一定量的化合物TR1溶于乙腈中，配成浓度为1.0×10-3mol/L的贮备液，使用0.02 mol/L Tris-HCl溶液(pH=7.0)稀释到所需浓度，保持CH3CN与H2O的体积比为1∶1。

1.2 化合物TR1的合成与表征

将三聚氯氰(0.102 g，0.6 mmol)溶于20 mL二氧六环，加入缚酸剂K2CO3(0.3 g，2.3 mmol)，滴加20 mL罗丹明乙二胺(0.826 g，1.8 mmol)的二氧六环溶液，30 min滴加完毕。N2保护，控制温度9 ℃反应2 h，升至室温反应2 h，回流反应2 h，溶液为浅棕黄色。减压蒸除二氧六环，得棕黄色固体，经丙酮重结晶，得到0.39 g橘粉色固体TR1，产率42%，熔点：208-209 ℃。ESI-MS:1529.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3):(=1.12(t,J=8.9Hz,36H,CH3),3.36(m,24H,CH2),3.54(t,J=2.6Hz,6H,CH2),6.27(m,6H,ArH),6.38(m,6H,ArH),6.54(m,6H,ArH),7.01(s,3H,NH),7.04(m,3H,ArH),7.18(t,J=6.0Hz,3H,ArH),7.56(t,J=6.4Hz,3H,ArH),7.84(d,J=7.5Hz,3H,ArH)。13C NMR(100 MHz,CDCl3):(=12.9,45.8,47.1,76.5,106.5,114.3,127.7,128.0,128.8,130.2,132.3,139.2,149.4,151.9,162.5,169.3。IR：3429.45 cm-1(-N-H),2970.96 cm-1和2929.09 cm-1(-C-H),1689.96 cm-1(-C=O),1615.39 cm-1和1514.71 cm-1(-C=C和-C=N),1220.21 cm-1(-C-O-)和1118.41 cm-1(-C-N-)。

2 结果与讨论

2.1 金属离子光谱识别性能

在4 mL CH3CN/H2O(体积比1∶1)的TR1溶液中加入不同浓度的Cu2+，分别测定紫外可见吸收光谱和荧光光谱，如图2所示。随着Cu2+浓度的升高，TR1在553 nm处的吸收峰逐渐增强，加入20倍摩尔当量的Cu2+，吸收光谱基本稳定。溶液颜色由无色变为玫红色，而加入Na+、K+、Al3+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Fe3+、Hg2+、Zn2+、Ba2+、Pb2+等其它金属离子，TR1不产生明显的吸收光谱变化和颜色变化。TR1对Cu2+的选择性响应不受其它金属离子干扰(图2(b))。

图2 紫外可见吸收光谱图和荧光光谱图

荧光光谱滴定结果如图3所示，加入Cu2+，TR1在580 nm出现新的荧光发射峰。当Cu2+的加入量为20倍摩尔当量时，TR1的荧光强度增强约100倍。但是加入其它金属离子，TR1荧光光谱变不出现显著变化，并且对Cu2+响应不产生干扰，表明TR1对Cu2+的荧光识别具有较高的选择性。光谱研究结果表明，TR1与Cu2+络合后，罗丹明螺酰胺环发生开环，形成了共轭体系较大的荧光化合物，进而出现明显的吸收光谱和发射光谱[20-21]。

图3 荧光光谱滴定结果图

2.2 溶剂体系对TR1-Cu2+识别的影响

溶剂体系对TR1和Cu2+识别反应的影响如图4所示。在含水比例为0～80%的CH3CN体系中，TR1与Cu2+之间的相互作用基本不受影响。当CH3CN/H2O的体积比为90%时，吸光度和荧光强度均有略微降低，说明较多的水可能导致化合物的溶解度降低或强水合作用导致荧光化合物分解。探针分子TR1的分子光谱性能不随溶剂体系的变化而发生明显改变。考虑其在生理细胞体系和环境体系中应用和确保较高响应灵敏度的前提下，本文选择V(CH3CN)/V(H2O)=1∶1体系，对TR1-Cu2+进行光谱分析测试研究。

图4 溶剂体系对TR1和TR1-Cu2+识别体系的影响

2.3 pH对TR1-Cu2+识别的影响

考察pH对TR1和TR1-Cu2+的吸收光谱和发射光谱的影响(图5)。由图5可知，在较宽的pH范围内(3.0～7.5)，TR1对Cu2+的光谱响应基本保持稳定。在强酸和强碱条件下，TR1与Cu2+不发生作用，原因可能在于强酸环境会引起TR1分解；强碱可能导致溶液中Cu2+沉淀，不利于形成稳定的铜离子配合物。考虑TR1探针检测体系在生理环境中的潜在应用，便于后期的细胞荧光成像研究，本文控制溶液pH=7.0。

图5 pH对TR1和TR1-Cu2+识别体系的影响

2.4 水样品中Cu2+检测

在最优条件下，V(CH3CN)/V(H2O)=1∶1，pH=7.0，采用荧光光谱建立TR1荧光强度对Cu2+浓度的标准工作曲线。在4.0×10-7mol/L～5.0×10-6mol/L浓度范围内，线性拟合方程为：FI580=160.5CCu2+-72.4，相关系数R=0.9965，以3倍标准偏差计算得到最低检出限为8.0×10-8mol/L，如图6所示。以自来水和河水作为Cu2+样品，重复测定三次，结果见表1。为验证该测定方法的准确性，测定Cu2+加标回收率约为100%，相对标准偏差RSD(4%，该方法基本满足精密度要求。

图6 TR1对Cu2+的荧光检测标准工作曲线

样品加入Cu2+浓度/(10-7 mol/L)检测Cu2+浓度/(10-7 mol/L)回收率/%RSD/(%,n=3)自来水0.00101.401013.55.00106.521021.815.00115.98972.130.00131.23992.3河水0.00140.371054.010.00150.491013.420.00160.25992.540.00180.411002.1

3 结 论

(1)成功合成一种新型三嗪罗丹明荧光探针分子TR1，可选择性灵敏检测Cu2+。溶剂体系和pH变化对TR1-Cu2+识别体系的紫外可见吸收光谱和荧光光谱变化的影响较小。

(2)探针TR1可用于实际样品中Cu2+检测，回收率和RSD均达到要求，有望用于水环境和生命体系中Cu2+的选择性准确检测。

学生在全面捕捉课文的信息后，不出所料，一个智勇双全的武松呼之欲出。正当探究欲止，我又引导他们比较“武松打虎”与“李逵打虎”。结果发现：前者赤手空拳，后者手握板斧，所以尽管李逵杀死四虎不敌武松打死一虎名气大。同学们为自己的发现激动不已。探究又要止步时，我又适时引入明末清初金圣叹先生对武松的评价。一石激起千层浪，以别人的评价来观照自己的解读，相互补充着，相互启发着，结果收效甚好。

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