FOXP3与TGF-β1在卵巢异位子宫内膜中的表达及意义

赵 娟，樊晓慧，韩晓兵

(西安交通大学第一附属医院妇产科，西安 710061;*

子宫内膜异位症(endometriosis,EMS)是影响育龄期女性生殖健康的主要疾病之一，其确切的发病机制至今尚未阐明，越来越多的研究表明免疫调节异常在內异症的发生、发展环节起重要作用[1]。免疫调节因子Treg和TGF-β在很多肿瘤的发生发展中具有促进作用，而内异症又具有某些类似恶性肿瘤的生物学行为特征，那么Treg和TGF-β所介导的负向免疫调控作用在内异症的发病中是否起到相似作用呢？我们通过研究异位子宫内膜中Treg表面特异性分子FOXP3以及TGF-β的亚型TGF-β1的表达，进一步明确子宫内膜异位症发生及发展过程中的免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1 患者及组织标本

选择西安交通大学第一附属医院妇科2014-02～2015-02因卵巢子宫内膜异位症行手术治疗的病例共40例，患者年龄22-45岁，取其卵巢异位子宫内膜组织作为异位内膜观察组；取同期因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的正常在位子宫内膜作为在位内膜对照组，共40例，患者年龄40-49岁；取同期因子宫肌瘤行全子宫+双附件切除术患者的卵巢组织作为正常卵巢组织对照组，共40例，年龄47-50岁。排除术前6个月内使用过激素及免疫抑制剂的病例；排除患有严重心、肝、肾脏疾病及恶性肿瘤患者。所有取得标本患者均签署知情同意书，且入组标本均经病理组织学证实。

1.2 试剂

兔抗人FOXP3抗体及羊抗人TGF-β1抗体购自美国Abcam公司。

1.3 FOXP3及TGF-β1的检测

1.3.1 FOXP3及TGF-β1蛋白表达检测 组织标本进行石蜡包埋，切为4 μm厚的石蜡切片；脱蜡并脱水后，抗原修复，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，加入山羊血清封闭液，滴加一抗(稀释比例为1 ∶100)50 μl，过夜后滴加二抗(稀释比例为1 ∶100)40 μl，用DAB试剂显色，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片，光学显微镜(Olympus BH-2)镜检。

1.3.2 FOXP3结果判读 FOXP3是以棕褐色颗粒位于细胞核内判定为阳性染色结果。计数FOXP3阳性细胞：低倍显微镜(10×10)下观察切片中FOXP3的分布情况，选择阳性细胞分布较多的区域，在其中随机选择10个高倍视野(10×40)，分别计数10个视野中的阳性细胞，数阳性细胞数，按研究使用显微镜系统计算得每高倍镜视野为0.46 mm2，将计数结果换算为个/mm2。

1.3.3 TGF-β1结果判读 TGF-β1蛋白表达均以胞质内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。为方便进行统计分析，参照文献[2]中的评分方法，首先将染色强度评分：0分为阴性,未着色；1分为弱,淡黄色；2分为中度,黄色；3分为强,棕黄色；4分为很强,褐色；在观察的10个高倍视野中，每个视野计数100个细胞，按其中阳性细胞所占的百分比平均值评分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤25%，2分为25%-50%，3分为50%-75%，4分为>75%。染色强度与阳性细胞的分值相加，0-1分为阴性(-)；2-3分为弱阳性(+)；4-5分为中度阳性(++)；>5分为强阳性(+++)。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析处理数据。对比各组FOXP3及TGF-β1的表达差异采用秩和检验；相关分析采用等级资料的Spearman相关性分析。以P<0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FOXP3及TGF-β1在卵巢异位内膜、正常在位内膜及正常卵巢组织中的表达

FOXP3在卵巢异位内膜组织中高表达(见图1),显著高于正常在位内膜(P=0.000)及正常卵巢组织(P=0.000)；正常在位内膜及正常卵巢组织中不表达或者很少表达FOXP3(见图1)，两组间FOXP3表达水平差异无统计学意义(P=0.592,见表1)。

A.卵巢异位内膜B.正常在位内膜C.正常卵巢组织图1 FOXP3在卵巢异位内膜、正常在位内膜及正常卵巢组织中的表达 (×400) Figure 1 Expression of FOXP3 in ovarian endometriotic specimen, normal endometrium specimen and normal ovarian specimen (×400)

表1FOXP3及TGF-β1在卵巢异位内膜、正常在位内膜及正常卵巢组织中的表达

Table1ExpressionofFOXP3andTGF-β1inovarianendometrioticspecimen,normalendometriumspecimenandnormalovarianspecimen

组织类型nFOXP3-+阳性率χ2PTGF-β1-++++++χ2P 卵巢异位内膜2021890.0%14.7a 0.000a15684.34a0.037a正常在位内膜2017315.0%22.55b0.000b312328.12b0.010b正常卵巢组织108220.0%0.495c0.592c25210.085c0.770c

a卵巢异位内膜与正常卵巢组织相比；b卵巢异位内膜与正常在位内膜相比；c正常在位内膜与正常卵巢组织相比

TGF-β1在卵巢异位内膜组织中多呈中度阳性、强阳性表达(见图2)，显著高于正常在位内膜(P=0.010)及正常卵巢组织(P=0.037,见表1)；正常在位内膜及正常卵巢组织中TGF-β1多呈弱阳性、中度阳性表达(见图2)，两组间TGF-β1表达水平差异无统计学意义(P=0.770,见表1)。

A.卵巢异位内膜B.正常在位内膜C.正常卵巢组织图2 TGF-β1在卵巢异位内膜、正常在位内膜及正常卵巢组织中的表达 (×400) Figure 2 Expression of TGF-β1 in ovarian endometriotic specimen, normal endometrium specimen and normal ovarian specimen (×400)

2.2 FOXP3及TGF-β1表达的相关性

FOXP3和TGF-β1在卵巢异位内膜组织中的表达呈正相关(r=0.667,P=0.001)。FOXP3和TGF-β1在正常在位内膜组织及正常卵巢组织中的表达无相关性(见表2)。

表2FOXP3及TGF-β1在组织中表达的相关性

Table2ThecorrelationofFOXP3andTGF-β1expressioninovarianendometrioticspecimen,normalendometriumspecimenandnormalovarianspecimen

组织类型rP卵巢异位内膜0.6670.001正常在位内膜0.1870.096正常卵巢组织0.1760.118

3 讨论

子宫内膜异位症是一种雌激素依赖的慢性炎症性疾病，其发病机制迄今仍未阐明。越来越多的研究表明免疫调节异常在内异症的发生、发展环节中起重要作用。当有活性的子宫内膜细胞异位于子宫腔以外的部位，没有被免疫系统识别和清除，且在异位处发生侵袭、黏附以及生长，则形成内异症病灶[3,4]。那么是什么原因导致内异症患者免疫系统功能调节异常，不能及时识别和清除异位内膜，内异症患者又是处于什么样的免疫异常状态，我们将通过研究具有负向免疫调节功能的Treg和TGF-β进一步阐明。

3.1 FOXP3在卵巢异位子宫内膜组织中的表达及其意义

Treg是一类重要的负向免疫调节细胞，FOXP3特异性地表达于Treg细胞，且只有表达FOXP3的Treg细胞才具有免疫抑制作用，故可以通过检测FOXP3的表达情况来定量分析组织中Treg的数量[5-7]。大量研究表明，在肿瘤组织中，Treg数量增多，其在导致肿瘤细胞产生免疫逃逸、机体抗肿瘤免疫应答低下中起到重要作用[8]，那么FOXP3在内异症中的生物学行为是否值得研究。既往有研究[9]比较了卵巢EMs病灶和分泌期子宫内膜组织中的CD4+CD25+FOXP3+细胞亚群，发现卵巢EMs内膜组织中Treg细胞显著升高。

本研究发现FOXP3在卵巢异位内膜组织中高表达，在正常在位内膜及正常卵巢组织中不表达或者很少表达，而FOXP3做为Treg细胞的特异性表面标志，说明异位内膜组织中Treg数量增多。提示内异症的发病可能与局部Treg细胞浸润增加有关，由于Treg有免疫抑制作用，导致局部免疫应答低下，使得异位的子宫内膜能够逃避免疫监视，在局部侵袭、黏附、定植，形成内异症病灶。这与李晓贻等[10]的研究结果一致。

3.2 TGF-β1在卵巢异位内膜组织中的表达及意义

TGF-β是一种以抑制免疫为主的负向调节因子，参与了肿瘤发生发展、免疫反应、创伤修复以及细胞间质的形成等各种生理过程，TGF-β1是TGF-β在体细胞系中占比最高(>90%)、活性最强的一种亚型。有研究表明，在子宫内膜异位症发生发展的多个环节中，TGF-β都可能存在着重要的作用，尤其是在异位内膜黏附的过程中起到始动作用。由于TGF-β具有免疫抑制作用，导致局部免疫系统的功能失衡，促使异位的子宫内膜产生了免疫逃逸，为异位的子宫内膜在局部的定植和生长创造了条件，故认为TGF-β的异常表达可能与内异症患者异位内膜组织的生长和盆腔组织的粘连相关[11]。

本研究发现TGF-β1在在卵巢异位内膜组织中多呈中度阳性、强阳性表达，在正常在位内膜及卵巢组织中多呈弱阳性、中度阳性表达。这个结果提示TGF-β1可能通过负向免疫调节及诱导血管生成等机制促进了内异症的发生发展；而内异症病灶通常会与周围组织发生粘连，可能与TGF-β1的促纤维化功能相关[12]。

3.3 FOXP3及TGF-β1在卵巢子宫内膜异位组织中表达的相关性

有研究发现[13]，TGF-β的家族成员是维持Treg细胞数量及功能的重要因子，可以诱导CD4+CD25-T细胞表达FOXP3，使其转化为具有抑制功能的CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞；TGF-β还能够通过剂量依赖的方式，在体内促进Treg细胞表达FOXP3，且只有表达FOXP3的Treg细胞才被认为是真正起作用的Treg细胞[14]；TGF-β在Treg免疫抑制作用发挥过程中也有重要作用，Treg细胞可以分泌TGF-β，产生抑制B淋巴细胞增殖、抑制B淋巴细胞分泌IgM的效应。

在对多种恶性肿瘤的研究中[15,16]发现FOXP3和TGF-β1的表达同时增加，且呈正相关，与不良预后相关。因而我们观察了内异症患者病灶组织中FOXP3与TGF-β1表达水平的相关性，结果发现在卵巢异位内膜组织中FOXP3和TGF-β1的表达呈正相关，从而推测FOXP3和TGF-β1在内异症中具有协同作用，共同促进内异症的发生发展。但是其作用的确切机制，仍有待更加深入的研究。

综上所述，内异症患者中，病变局部的负向免疫细胞Treg数量增多，负向免疫调节因子TGF-β的表达增多，在两者的共同作用下，免疫状态被抑制，从而促进了内异症的发生及发展。

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