小檗碱增强丝裂霉素C诱导的膀胱癌T24细胞周期阻滞及凋亡*

秦晓平，詹雄宇，陈奇彪，黄保元，黄 君，卓育敏△

(暨南大学附属第一医院 1泌尿外科， 2超声科， 广东 广州 510632)

膀胱癌在发达工业国家是最常见的泌尿外科恶性肿瘤之一,其在临床上主要分为两大类型，一是非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)；二是肌层浸润性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer, MIBC)，其中NMIBC发病率占所有膀胱癌的70%～80%[1]。经尿道膀胱肿瘤电切术(transurethral resection of bladder tumor, TURBT)和术后辅助性膀胱灌注治疗[2-3]是治疗 NMIBC的标准疗法。临床研究显示膀胱灌注丝裂霉素C (mitomycin C, MMC；又称自力霉素)，可以有效地预防低危浅表性膀胱癌的复发[4]。国内也有相关研究报道[5]，应用丝裂霉素灌注膀胱治疗58例浅表性膀胱癌患者并取得较好的疗效。虽然MMC作为一种拥有确切治疗效果的膀胱灌注化疗药物，并已广泛应用到临床各类型肿瘤的术后辅助化疗中，但是它的不良反应仍限制了它在治疗膀胱癌中的应用。所以，寻找一种对治疗膀胱癌具有更高疗效，又能通过降低MMC灌注剂量从而减少对正常细胞损伤的治疗方法，具有十分重要的临床意义。

小檗碱(berberine，Ber)作为一种天然的异喹啉类生物碱，是从黄连属草本植物中分离的，具有多种药理及生物学活性，包括抗肿瘤，降血脂，抗微生物和抗炎等[6-9]，其抗肿瘤作用已成为近年来研究的热点。大量的研究表明，小檗碱对骨髓、肝、肺、胃肠道、膀胱和前列腺等类型肿瘤细胞的生长具有抑制作用[6-8]。研究发现，小檗碱的抗肿瘤的特性与其抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，引起细胞周期阻滞和细胞迁移的抑制有关[10-11]。此外，有研究发现，Ber (1 μmol/L)能增强表阿霉素和阿霉素诱导膀胱癌T24细胞的细胞凋亡和细胞周期阻滞，从而增强其对膀胱癌细胞的抗增殖作用，其机制可能与内源性凋亡信号通路激活有关[12-14]。然而小檗碱联合丝裂霉素对膀胱癌细胞是否有影响？目前尚缺乏深入研究。因此，本文观察小檗碱联合丝裂霉素C对膀胱癌细胞T24的细胞周期及凋亡的影响，并探讨潜在的作用机制。对寻找一种对治疗膀胱癌有更高疗效，又能减少其副作用的治疗方法，具有十分重要的临床意义。

材 料 和 方 法

1 主要材料

人类膀胱癌T24细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院(目录编号：TCHu55)。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、RPMI-1640培养基、0.25%胰酶和双抗(青霉素和链霉素)均购自HyClone；细胞增殖活性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)购自Dojindo；中性硫酸小檗碱购自Sigma；注射用丝裂霉素(每支2 mg)购自浙江海正药业股份有限公司；本研究中所使用的所有抗体均购自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1T24细胞培养 细胞采用含10% FBS和10% 双抗的RPMI-1640培养基培养，于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养。将T24细胞分为4组：对照(control)组、MMC组、MMC联合Ber(MMC+Ber)组和Ber组。

2.2CCK-8法检测T24细胞活力 以每孔2×104个细胞接种于96孔细胞培养板中，24 h后取出细胞培养板观察细胞的生长情况。分别加入不同剂量的小檗碱(0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和2.0 μmol/L)和/或丝裂霉素(150 μmol/L)，设置空白对照(control,Ctrl)组。分别培养24 h和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8检测试剂，置于培养箱汇总继续培养30 min。随后用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度(A)，以上实验重复3次。细胞活力(%)=实验组A值/对照组A值×100%。

2.3流式细胞术检测各组细胞周期分布 将T24细胞以每孔1×106个细胞接种于6孔细胞培养板中培养24 h,后按分组对其进行加药，24 h后收集细胞，1 500 r/min离心5 min，再用PBS洗涤细胞1次。每管500 μL 70%乙醇重悬细胞，放置-20 ℃ 固定过夜。第2天染色前，用PBS洗去乙醇，1 500 r/min离心5 min，加入5 μL RNase A，37 ℃ 水浴30 min，再加入10 μL PI染色液，充分混匀后于室温下避光孵育15 min后即可用流式细胞仪检测。

2.4Western blot 检测蛋白表达 将T24细胞以每孔1×106个细胞接种于6孔板细胞培养板中培养24 h后对其进行加药，24 h后获得细胞沉淀。用预冷的PBS洗涤细胞2次，每孔加入150 μL含PMSF的RIPA裂解液，吹打混匀后置于冰上裂解30 min，每隔10 min 用细胞刮刀刮1次细胞，让RIPA裂解液与细胞充分混匀，收集上述混合液于EP管中，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，吸取上清，BCA蛋白定量测定试剂盒(碧云天)进行蛋白定量。以12% SDS-PAGE分离，半干转法转移至PVDF膜，转膜结束后取出PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。根据marker位置切取目的条带，分别加入相应的Ⅰ抗于4 ℃孵育过夜。第2天，加入相应的辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，室温孵育1 h。在膜上滴加ECL发光液，X线底片曝光，GAPDH作为内参照。上述实验重复3次。

2.5Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡 每孔以1×106个细胞接种于6孔细胞培养板中，培养24 h后对其进行加药处理，24 h后收集细胞，包括漂浮在培养基上的细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μL Binding Buffer，重悬混匀后，加入5 μL Annexin V-FITC，室温下避光孵育10 min染色，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μL Binding Buffer 充分重悬混匀后，加入5 μL PI染色，上机检测各组细胞的凋亡率。上述实验重复3次。

3 统计学处理

所有数据采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准误(mean±SEM)表示，多组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间均数两两比较采用Bonferroni法检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 CCK-8法检测T24细胞活力

不同浓度(0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和2.0 μmol/L)的Ber协同MMC(150 μmol/L) 分别处理T24细胞24 h和48 h后，用CCK-8法检测细胞活力，结果提示,处理48 h后，MMC+Ber组较MMC组对T24细胞活力的抑制效果更明显(P<0.05)，见图1。

Figure 1. The viability of T24 cells treated with MMC and Ber for 24 h and 48 h. Mean±SEM.n=3;*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMMC group.

图1Ber联合MMC对T24细胞活力的影响

2 流式细胞仪检测T24细胞周期结果

如图2所示，加药处理T24细胞24 h后，MMC+Ber组较MMC组有更多细胞阻滞在G0/G1期，并且T24细胞在S期细胞数量明显减少(P<0.05),见图2。

Figure 2. Effects of MMC and Ber on cell cycle in T24 cells. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol (Ctrl) group;#P<0.05vsMMC group.

图2Ber联合MMC对T24细胞周期的影响

3 Ber对MMC处理后的T24细胞p21、p27、CDK2、CDK4、cyclin D1和survivin蛋白表达的影响

Western blot实验结果显示，与MMC组相比，MMC+Ber组能上调p21和p27蛋白的表达(P<0.05)，并且能下调cyclinD1、CDK2、CDK4以及survivin蛋白的表达(P<0.05)，见图 3、4。

Figure 3. Effects of Ber on p21 and p27 protein levels in MMC-treated T24 cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol (Ctrl) group;#P<0.05vsMMC group.

图3Ber对MMC诱导的T24细胞p21和p27蛋白表达的影响

Figure 4. Effects of Ber on the protein expression of CDK2, CDK4, cyclin D1 and survivin in T24 cells treated with MMC for 24 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol (Ctrl) group;#P<0.05vsMMC group.

图4Ber对MMC诱导的T24细胞cyclinD1、CDK2、CDK4和survivin蛋白表达的影响

4 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测结果

Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡的结果显示,MMC+Ber 组细胞凋亡率明显高于MMC组(P<0.05)，以上结果表明Ber能促进MMC诱导T24细胞凋亡,见图5。

讨 论

TURBT是目前治疗NMIBC的标准治疗方法， 然而术后仍有较高的肿瘤复发率，所以，术后行膀胱辅助灌注化疗或者免疫治疗已成为预防肿瘤复发和进展的重要手段之一。目前临床上膀胱灌注化疗及免疫治疗药物的种类较多，常用的有蒽环类药物[15-17]。MMC是临床上较为常用的膀胱癌术后化疗药物之一。近年来，术后灌注MMC对控制肿瘤复发得到了证实。但长期高剂量的使用会导致患者出现血尿、尿频和尿急等刺激症状从而导致膀胱储尿时间变短，甚至会影响药物治疗的时间，影响治疗效果。同时蒽环类药物的心脏毒副作用亦限制了其在临床上的应用。同时Lv等[18]报道小檗碱能抑制阿霉素引起的心肌细胞凋亡。Li等[19]研究发现小檗碱能通过抑制ROS的产生，抑制H2O2诱导的大鼠骨髓间充质干细胞细胞凋亡。综上所述，小檗碱一方面能抑制肿瘤细胞生长，另一方面它能保护正常体细胞。如果将Ber和MMC联合用药能否起到增强对膀胱癌的疗效，同时又减轻丝裂霉素的毒副作用？目前尚缺乏相关研究。

Figure 5. The effects of Ber on the apoptosis of MMC-induced T24 cells detected by flow cytometry. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol (Ctrl) group;#P<0.05vsMMC group.

图5流式细胞术检测Ber联合MMC诱导T24细胞凋亡率

本课题组前期用CCK-8法检测药物处理后的T24 细胞，结果表明Ber能增强MMC抑制T24细胞的增殖能力。肿瘤细胞的生长以及分化必须要求细胞分裂具有严格的精确性和定时性，而细胞周期有着严格的顺序，即从G1→S→G2→M，这其中有若干重要关卡，其中G1/S和G2/M转换是其中最重要的2个关卡之一，前者称作启动点，或者限制点。为了进一步揭示Ber增强MMC抑制T24细胞增殖的机制，本实验检测了细胞周期及调控细胞周期的相关蛋白表达情况，发现Ber+MMC组G0/G1期细胞比例较Ber组和MMC组增高，S期细胞比例降低，表明Ber能够促进MMC引起T24的细胞周期阻滞。目前认为p21和p27是重要的细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂，它们能结合绝大部分的cyclin-CDK复合物，从而抑制其活性，起到调控细胞周期的作用[20-22]。因此我们测定了p21和p27以及其下游的周期调控相关蛋白cyclin D1、CDK2和CDK4蛋白的表达水平。本实验发现Ber显著上调p21和p27的表达(P<0.05)，抑制CDK-2、CDK-4和cyclin D1的表达(P<0.05)。这提示Ber能够促进MMC加强对膀胱癌T24细胞周期抑制作用，其主要机制可能是通过上调p21和p27，进而导致CDK和cyclin D1相关周期蛋白的表达减少，阻断细胞从G1期向S期进展从而使细胞周期停滞在G1/G0期。Survivin在各种肿瘤细胞中过表达，它不仅能调控细胞周期，且具有抑制细胞凋亡的作用。同时survivin近年来被认为是膀胱癌诊断和预后的一个有价值的指标。它是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis，IAP)家族中最小的成员，不仅具有抑制细胞凋亡的作用，还能调控细胞周期。Western blot结果显示，Ber+MMC处理T24细胞后其survivin蛋白表达水平较单用MMC和control组均亦显著下降，Ber能增强MMC诱导膀胱癌T24细胞凋亡。

Ber应用历史悠久，价格便宜，且研究表明它对正常体细胞具有保护作用，如能利用其优势开发新的化疗药剂，并进行相关研究，这将为治疗膀胱癌提供了新的策略和思路。

[参 考 文 献]

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