上调miR-133a表达水平对自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响*

谭文鹏，李文杰，黄兆琦

(广州医科大学附属第三医院心内科， 广东 广州 510150)

高血压是发病率极高的心血管疾病，可以诱导心肌纤维化和细胞凋亡等心肌重构表现，最终导致心力衰竭。微小核糖核酸(microRNA，miRNA,miR)通过与目标基因的信使RNA结合，调控其翻译水平从而影响目标蛋白的表达[1-3]。miRNAs在心肌重构、增殖和分化等过程中具有重要的调控作用[4-5]。miR-133a是心肌组织中含量最丰富的miRNA之一，密切参与心肌肥厚和细胞凋亡等病理生理过程[6-7]。在心肌梗死患者及动物模型中，心肌组织中miR-133表达水平均明显降低[8-9]。近期研究显示，miR-133a有望成为心血管疾病新的治疗靶点[6, 10]。本文通过上调心肌组织中miR-133a表达水平，观察其对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)心肌纤维化的影响。

材 料 和 方 法

1 实验动物和试剂

14周龄的雄性SHR随机分为SHR组、空白病毒转染(SHR+AAV)组和miR-133a过表达(SHR+miR-133a-AAV)组，每组8只,另取8只14周龄的雄性Wiskar-Kyoto(WKY)大鼠设为正常对照(WKY)组。大鼠体质量220～240 g，购自北京维通利华生物公司，许可证编号为SCXK(京)2013-0009，清洁环境喂养。采用心脏亲和性高的9型腺相关病毒(adeno-associated virus-9,AAV-9)作为载体。AAV和miR-133a-AAV 由深圳百恩维公司合成。抗转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)小鼠单克隆抗体(MAB240，R&D)；抗结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)兔多克隆抗体(ab6992，Abcam)；抗β-actin抗体(Jackson，稀释度1∶1 000)；TRIzol试剂(Invitrogen)；miScript Reverse Transcription Kit、miR-133a引物和内参照U6引物(QIAGEN)。

2 方法

2.1携带miR-133a的腺相关病毒构建 首先构建中间载体质粒pGenesil-12-pre-miR-133a,限制性酶切位点后的片段中包含了启动子及目的基因miR-133a的2个臂，即miR-133a-5’和miR-133a-3’；然后构建腺相关病毒质粒pAAV-pre-miR-133a，包含转录终止信号和哺乳动物细胞高水平基因表达的相关元件。将质粒导入AAV-293细胞，产生含目的基因miR-133a的腺相关病毒，滴度1×1011TU/L。

2.2大鼠血压测量 在大鼠安静清醒状态下用无创测压法测定大鼠尾动脉压。恒温系统加热至39 ℃，使尾动脉出现明显的搏动波，尾袖气囊充气，阻断尾动脉搏动波，缓慢放气测量血压，反复测量3次。

2.3miR-133a-AAV转染大鼠心肌 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，仰卧位固定。暴露气管，横向剪开气管2～3 mm，插管连接小型动物呼吸机行呼吸支持，设定呼吸频率70次/min，潮气量10～12 mL，呼吸比1∶1。开胸后暴露心脏,采用冠脉灌注法转导病毒载体：miR-133a-AAV组大鼠左心室腔内注射0.1 mL miR-133a-AAV，空白病毒组注射0.1 mL AAV。注射病毒液的同时用血管钳夹闭主动脉10 s，使病毒液不能进入体循环而泵入冠状动脉。关胸后撤除呼吸机，缝合颈部皮肤。

2.4大鼠心肌组织Masson染色及观察 4组大鼠均在转染4周后(18周龄时)取心脏标本。心肌组织石蜡切片行Masson胶原染色，光学显微镜下观察心肌组织胶原改变。测量心肌胶原容积分数[collagen volume fraction,CVF，CVF(%)=心肌胶原面积∕所测视野面积×100%]及血管周围胶原面积与管腔面积比率(perivascular collagen area to lurninal area ratio，PVCA/LA=小动脉周围胶原面积∕小动脉管腔面积)。

2.5免疫组织化学染色 切片脱蜡后抗原热修复，消除内源性过氧化物酶，分别加入小鼠抗大鼠TGF-β1单克隆抗体(1∶50)和兔抗大鼠CTGF兔多克隆抗体(1∶800)，4 ℃孵育过夜；相应 II 抗室温孵育2 h；ABC工作液孵育后DAB法显色。光学显微镜下观察，棕色颗粒为阳性。

2.6Western blot检测 提取心肌组织总蛋白，测定蛋白浓度；行10% SDS-PAGE 分离蛋白质，转膜；封闭1 h，加入抗TGF-β1小鼠单克隆抗体(1∶10 000)和CTGF兔多克隆抗体(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜；加入羊抗鼠II抗(1∶2 000)和羊抗兔 II 抗(1∶5 000)室温孵育1 h；显色显影定影，扫描胶片，用图像分析软件进行灰度分析。

2.7Real-time PCR 提取大鼠心肌总RNA；逆转录合成cDNA，逆转录反应体系为miScript HiFlex Buffer 2 μL、Nucleics Mix 1 μL、miScript Reverse Trans-criptase Mix 1 μL和总RNA 6 μL。miR-133a的上游引物序列为5’-GCCAAGCTGGTAAAATGGAA-3’，下游引物序列为5’-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3’，内参照U6的上游引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGCG-3’。PCR反应体系为cDNA 1 μL、miScript Universal Primer 1 μL、miR-133a引物或U6引物各1 μL、SYBR Green qPCR Mix 10 μL和水7 μL。PCR扩增反应完成后，在实验系统中调整基线和阈值，达到阈值时的循环数为各反应孔的Ct值。目的基因相对量用2-ΔΔCt法计算。

3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。检测结果以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠的一般情况

与对照组比较，SHR组、SHR+AAV组和SHR+miR-133a-AAV组大鼠的尾动脉收缩压(systolic blood pressure,SBP)和舒张压(diastolic blood pressure,DBP)均明显升高,见表1。

表1 各组大鼠尾动脉压与心肌胶原含量的变化Table 1. Comparison of tail artery pressure and collagen in myocardial tissues of the rats (Mean±SD. n=8)

*P<0.05vsWKY group;#P<0.05vsSHR group.

2 大鼠心肌组织中miR-133a的表达

SHR组大鼠心肌组织中miR-133a表达水平明显低于对照组；冠脉灌注miR-133a-AAV至大鼠心脏，4周后检测心肌组织中miR-133a的表达，发现miR-133a表达水平显著升高(P<0.05),见图1。

Figure 1. The expression of miR-133a in the myocardial tissues of rats. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsWKY group;#P<0.05vsSHR group.

图1各组大鼠心肌组织中miR-133a的表达

3 大鼠心肌组织Masson染色结果

与对照组相比，SHR组大鼠心肌细胞间隙增宽，可见大量蓝色胶原纤维沉积，出现明显的心肌纤维化，CVF和PVCA/LA明显升高(P<0.05);与SHR组相比，SHR+miR-133a-AAV组大鼠心肌细胞胶原沉积明显减少，心肌纤维化程度降低，CVF和PVCA/LA明显降低(P<0.05),见图2、表1。

4 大鼠心肌组织TGF-β1和CTGF蛋白表达的变化

免疫组化检测显示，TGF-β1主要在成纤维细胞中表达，分布在细胞膜、细胞浆及细胞间隙，CTGF表达在成纤维细胞及心肌细胞，主要分布在胞浆。对照组心肌组织中有少量TGF-β1和CTGF表达，SHR组心肌组织中可见TGF-β1和CTGF大量表达，SHR+miR-133a-AAV组心肌TGF-β1和CTGF表达减少，见图3、4。Western blot定量检测显示，SHR组心肌组织中TGF-β1和CTGF蛋白表达水平显著高于对照组，SHR+miR-133a-AAV组心肌组织中TGF-β1和CTGF蛋白表达水平明显低于SHR组(P<0.05),见图5。

Figure 2. Masson staining of the myocardial tissues of the rats (×400).

图2大鼠心肌组织Masson染色结果

Figure 3. The immunohistochemical staining for TGF-β1 in the myocardial tissues of the rats (×400).

图3大鼠心肌组织中TGF-β1免疫组化结果

Figure 4. The immunohistochemical staining for CTGF in the myocardial tissues of the rats (×400).

图4大鼠心肌组织中CTGF免疫组化结果

Figure 5. The protein levels of TGF-β1 and CTGF in the myocardial tissue of the rats. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsWKY group;#P<0.05vsSHR group.

图5各组大鼠心肌组织中TGF-β1和CTGF蛋白水平的变化

讨 论

miR-133a是肌肉特异性miRNA，在心肌组织中表达丰富。在心肌梗死患者和动物模型中，心肌miR-133a表达水平出现明显降低，并影响心肌收缩力[8-9]。研究显示，miR-133a基因敲除小鼠的心脏发生严重的心肌纤维化，并最终因心力衰竭死亡，表明miR-133a在心肌细胞间质合成平衡中具有关键作用[11]。高血压可导致心肌细胞外间质胶原沉积，引起心脏结构和功能异常。研究发现，在自发性高血压大鼠心肌组织中miR-133a的表达水平显著降低，伴随明显的胶原沉积[12],说明miR-133a可能参与高血压心肌纤维化的进程。

TGF-β1和CTGF是非常重要的促纤维化的细胞因子[13]。TGF-β1是调节细胞外间质代谢和启动纤维化的关键因子[14]；CTGF是TGF-β1促纤维化作用通路的重要下游因子，并维持纤维化进展[15]。TGF-β1在成纤维细胞及心肌细胞都能诱导产生CTGF。TGF-β1通过Smad信号通路以及细胞激酶C和Ras/MEK/ERK信号途径诱导CTGF合成，共同形成复杂的调控网络[15-16]。研究发现，在尼古丁刺激下的心房成纤维细胞中，miR-133a表达水平下调并导致TGF-β1蛋白水平显著升高，伴随大量胶原合成[17]；在SRF基因过表达的心肌肥厚动物模型中，miR-133a表达下调导致CTGF大量合成[18]。miR-133a与TGF-β1/CTGF有密切关系，但是miR-133a能否通过TGF-β1/CTGF途径调控高血压心肌纤维化尚不明确。

本研究发现，SHR的尾动脉压明显升高，伴随心肌细胞间隙大量胶原纤维沉积，导致心肌纤维化。病理检测显示SHR心肌成纤维细胞及心肌细胞合成大量TGF-β1及CTGF，蛋白定量检测也发现，SHR心肌TGF-β1及CTGF蛋白水平明显升高；上调SHR心肌miR-133a表达水平，抑制了心肌TGF-β1及CTGF蛋白合成，使心肌间隙的胶原沉积减少，心肌纤维化水平显著降低。

因此，我们推测miR-133a通过抑制TGF-β1及CTGF蛋白表达，对高血压心肌纤维化发挥调控作用，为高血压纤维化治疗寻找新靶点提供了依据。

[参 考 文 献]

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