高胆固醇饮食加铜水喂养WHBE兔引起的脑组织病理学改变

徐剑钦，陈民利，刘军平，陈娇娇，陈诚，潘永明,2*

(1. 浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究所，杭州　310053； 2. 浙江大学动物科学学院，杭州　310058)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以记忆减退和认知功能障碍等为主的神经退行性疾病，也是老年痴呆的主要类型[1]。AD主要病理特征包括细胞外大量β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaque, SP)、tau蛋白过度磷酸化导致的细胞内神经纤维缠结(neurofibril tangles, NFTs)和神经元丢失[2]。但到目前为止，AD的病因尚未明确。临床上仅有5%患者是以淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)、早老素1、早老素2基因突变为主的家族性AD(familial AD, FAD)，而95%患者属于散发性AD(sporadic AD, SAD)[3]，表明AD的发生与遗传和环境因素有关[4]。

动物模型是了解疾病的病因、发病机制以及防治药物研发的主要研究手段。虽然目前尚无完全理想的AD模型，主要以APPswe / PS1dE9双转基因小鼠、快速老化小鼠、或通过脑内注射Aβ、链脲佐菌素、AlCl3造成细胞损伤等，且模型动物大多以大小鼠为主，但由于它们缺乏正确的APP序列和缺少触发Aβ肽形成的切割酶[3]，使其并不适合作为SAD的天然模型。临床试验表明，在AD患者中Aβ依赖的信号传导途径不足以引起严重的神经系统衰退和痴呆[5-6]。但最近临床流行病学、动物实验和细胞研究表明高胆固醇可引起Aβ积累，高胆固醇血症被认为是AD发生的一个重要危险因素[7-9]。因此，研究人员正试图通过胆固醇代谢与Aβ的关系，来揭示AD的病因和病理机制。Sparks等[8]首次应用兔报道了胆固醇和Aβ斑块之间的联系，并进一步发现在兔中给予高胆固醇饲料的同时添加微量铜离子的饮水后，可在皮质中观察到淀粉样蛋白沉积物以及至少十二种在人类AD患者脑内也观察到的病理特征[10]，包括学习障碍[11]。提示兔可作为于散发性AD模型动物，因其能自发产生Aβ肽的切割酶，且兔Aβ肽序列与人类相同[12]。白毛黑眼(White hair and black eye, WHBE)兔是由本中心自主培育的新的实验兔品系，最近对WHBE兔脑MRI分析中，意外发现部分WHBE兔脑T2WI中颞叶海马区信号增强[13]，表现出侧脑室扩张、海马萎缩的迹象，是否提示WHBE兔在神经退行性疾病模型研究具有潜在的应用价值。为此，本研究分别采用高胆固醇饮食、高胆固醇饮食添加微量铜饮水诱导WHBE兔散发性AD模型，并与老年WHBE兔比较，观察各组脑部病理学的变化，为WHBE兔今后在神经退行性疾病中的应用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验动物

普通级成年雄性白毛黑眼兔(WHBE rabbit)30只，体重为1.8～2.0 kg，3～4月龄；普通级老年雄性WHBE兔10只，体重为3.0～4.2 kg，36～48月龄，由新昌大市聚镇欣健兔场提供【SCXK(浙)2015-0104】，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心兔实验室【SYXK (浙)2013-0184】，环境温度20～22℃，湿度40%～60%，12 h/12 h明暗交替。所有操作均遵守浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会要求(伦理批准号：ZSLL-2016-115)。

1.1.2主要试剂与仪器

全自动生化分析仪(7020，日立公司，日本)，连续光谱酶标仪(Thermo Varioskan Flash，Thermo Fisher公司，芬兰)，徕卡病理切片仪(RM2245，徕卡公司，美国)，全自动病理扫描切片仪(Nanozoomer S210，滨松公司，日本)；总胆固醇(TC)试剂盒，购自上海申能德赛诊断技术有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和Aβ1-42 ELISA试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；β-amyloid抗体、β-分泌酶1(β-site APP cleaving enzyme 1, BACE1)抗体、p-tau抗体，购自美国Santa Cruz公司。甲醇刚果红(Congo red)染色试剂盒，购自珠海贝索生物技术有限公司；皮尔苏斯基氏(Bielschowsky)改良法神经染色试剂盒，购自北京天恩泽基因科技有限公司。

1.2　方法

1.2.1散发性WHBE兔AD模型的建立

适应性饲养2周后，成年WHBE兔随机分成3组，即正常对照组(normal control group, NC)、高胆固醇饮食组(high cholesterol diet group, HCD)和高胆固醇饮食+铜水组(HCD+Cu2+group)，每组10只；另外10只老年WHBE兔作为老年组(senile)。正常对照组和老年组WHBE兔饲喂普通饲料和蒸馏水喂养；HCD组饲喂2%胆固醇饲料和蒸馏水喂养，HCD+Cu2+组饲喂2%胆固醇饲料和添加饮用含0.12 ppm铜离子(以硫酸铜的形式)蒸馏水，连续造模12周，并观察动物的精神行为及活动情况。

1.2.2血浆TC和Aβ1-42水平测定

造模12周后，动物禁食不禁水12 h，空腹称重，取耳中动脉肝素抗凝血2 mL，分离血浆，在全自动生化分析仪上测定血浆TC水平，并用ELISA法在连续光谱酶标仪上检测Aβ1-42水平，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.2.3脑组织中SOD活性和MDA含量的测定

取部分皮质和海马组织各100 mg，以1∶9比例加入4℃冷生理盐水，用组织匀浆机匀浆成10%匀浆液，然后在4℃ 3000 r/min离心20 min，吸取上清液，按试剂盒说明书测定脑组织中SOD活性和MDA含量。并采用考马斯亮兰法测定所有样品的蛋白质浓度，SOD和MDA水平标准化为样品中的总蛋白质含量。

1.2.4免疫组化法检测Aβ、BACE-1、p-tau蛋白的表达

动物安乐死后，取出大脑行冠状面切成5 mm厚小片，固定于4%甲醛溶液中至少24 h。用梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切成6 μm厚切片，并脱蜡至水，3%过氧化氢溶液灭活过氧化酶10 min，PBS液冲洗3次，滴加一抗：β-amyloid抗体(B-4，能识别APP和Aβ，1∶100)、BACE-1抗体(1∶100)、p-tau抗体(Thr231, 1∶300)，4℃孵育过夜。阴性对照用PBS替代一抗，PBS液冲洗3次，切片用二抗(HRP-标记的抗小鼠IgG)室温孵育1 h，PBS液冲洗3次，DAB显色，苏木精复染，脱水，树脂封片。图像分析与阳性面积计算：滨松全自动病理扫描切片仪扫描切片，采用双盲法随机取400倍下4个不重复的视野图像，用Image Pro Plus 6.0软件分析所捕获的图像中被染成黄色或棕黄色物质的阳性面积和统计场总面积，以阳性面积/统计场总面积比值作为脑皮质和海马中的阳性表达百分率。

1.2.5甲醇刚果红染色观察老年斑情况

取6 μm厚冠状切片，脱蜡至水，入Mayer苏木素染色10 min，水洗，1%盐酸乙醇分化数秒，温水显蓝，水洗；甲醇刚果红染色15 min，自来水冲洗数分钟，0.2%碱性乙醇分化数秒钟，水洗，常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.6Bielschowsky改良法染色观察神经纤维缠结情况

取6 μm厚冠状切片，脱蜡至水，加入预热至37℃ Bielschowsky硝酸银溶液避光浸染30 min；水洗，4%中性甲醛液还原数秒；用Bielschowsky氨银溶液滴染30 s，倾去染液，再用4%甲醛液还原，水洗；用氯化金溶液调色，水洗，加入海波溶液作用5 min；水洗，脱水，透明，中性树脂封固。神经元、轴突、神经纤维染成黑色。

1.3　统计学分析

2　结果

2.1　实验动物一般观察

造模12周后，正常对照组WHBE兔精神良好、活动好动、饮食正常，肢体健壮有力；HCD组WHBE兔有时出现眼睑半闭等精神恍惚症状，活动尚可；HCD+Cu2+组WHBE兔时常出现眼睑半闭等精神恍惚症状，甚至严重者出现前肢无力，常保持躺卧姿势、活动减少，并对外来刺激反应不敏感；老年组WHBE兔偶尔有眼睑半闭等精神恍惚症状，活动有所减少，对外来刺激反应相对较差。

2.2　各组WHBE兔的体重、血浆总胆固醇和Aβ1-42水平的变化

造模12周时，HCD组和HCD+Cu2+组WHBE兔的体重与正常对照组比差异无显著性(P> 0.05)，而老年组WHBE兔的体重显著高于正常对照组(P< 0.01)；另外，HCD组、HCD+Cu2+组和老年组WHBE兔的血浆TC和Aβ1-42水平均显著高于正常对照组(P< 0.05,P< 0.01)(图1)。

注：A. 体重；B. 总胆固醇水平；C. Aβ1-42水平。与正常对照组比，*P< 0.05, **P< 0.01；HCD组与HCD+Cu2+组比较，#P< 0.05, ##P< 0.01。图1　各组WHBE兔的体重、总胆固醇和Aβ1-42水平的变化Note. A. Body weight. B. Total cholesterol (TC) level. C. Aβ 1-42 level. Compared with the NC group, *P< 0.05, **P< 0.01. HCD group vs HCD+Cu2+ group, #P< 0.05, ##P< 0.01.Fig.1　Changes of body weight, total cholesterol and Aβ 1-42 levels in the rabbit n=10)

注：A. 各组脑皮质和海马组织中SOD活性水平；B. 各组脑皮质和海马组织中MDA含量。与正常对照组比，*P< 0.05, **P< 0.01；HCD组与HCD+Cu2+组比较，#P< 0.05, ##P< 0.01。图2　各组WHBE兔脑组织中SOD活性和MDA含量的变化Note. A. The levels of SOD activity in the cortex and the hippocampus of each group. B. The MDA contents in the cortex and the hippocampus of each group. Compared with the NC group, *P< 0.05, **P< 0.01. HCD group vs HCD+Cu2+ group, #P< 0.05, ##P< 0.01.Fig.2　Changes of SOD activities and MDA contents in the brain tissues of the rabbit n=8)

2.3　各组WHBE兔脑组织中SOD活性和MDA含量的变化

与正常对照组比，HCD组和HCD+Cu2+组WHBE兔脑皮质和海马组织中SOD活性均显著降低(P< 0.05)，MDA含量均显著升高(P< 0.05，P< 0.01)；另外，老年组WHBE兔脑皮质和海马组织中SOD活性也显著降低(P< 0.05)，海马组织中MDA含量显著升高(P< 0.05)，但脑皮质MDA含量与正常对照组比差异无显著性(P> 0.05)(图2)。

2.4　各组WHBE兔脑组织中Aβ表达的变化

免疫组化染色显示HCD组、HCD+Cu2+组和老年组WHBE兔脑皮质和海马组织中Aβ免疫染色阳性表达比正常对照组明显增加；定量分析显示，HCD组、HCD+Cu2+组和老年组WHBE兔脑皮质和海马组织中Aβ阳性表达百分率均显著高于正常对照组(P< 0.05，P< 0.01)(图3)。

2.5　各组WHBE兔脑组织中BACE1表达的变化

与正常对照组比，免疫组化染色显示HCD组、HCD+Cu2+组和老年组WHBE兔脑皮质和海马组织中BACE1阳性表达明显增加；定量分析显示，HCD组、HCD+Cu2+组和老年组WHBE兔脑皮质和海马组织中BACE1阳性表达百分率均显著高于正常对照组(P< 0.05，P< 0.01)；另外，HCD+Cu2+组WHBE兔脑皮质和海马组织中BACE1阳性表达百分率均显著高于HCD组(P< 0.05)(图4)。

注：A. 各组脑皮质和海马组织中Aβ染色代表图(×400)；B. 各组Aβ阳性表达百分率。与正常对照组比，*P< 0.05, **P< 0.01；HCD组与HCD+Cu2+组比较，#P< 0.05, ##P< 0.01。图3　各组WHBE兔脑组织中Aβ表达的变化Note. A. Representative Aβ-staining images in the cortex and the hippocampus of each group (×400). B. The covered area of Aβ staining in each group. Compared with the NC group, *P< 0.05, **P< 0.01. HCD group vs the HCD+Cu2+group, #P< 0.05, ##P< 0.01.Fig.3　Changes of Aβ expression in the brain tissues of each n=8)

注：A. 各组脑皮质和海马组织中BACE1染色代表图(×400)；B. 各组BACE1阳性表达百分率。与正常对照组比，*P< 0.05, **P< 0.01；HCD组与HCD+Cu2+组比较，#P< 0.05, ##P< 0.01。图4　各组WHBE兔脑组织中BACE1表达的变化Note. A. Representative BACE1-staining images in the cortex and hippocampus (×400). B. The percentage of positive BACE1 expression area. Compared with the NC group, *P< 0.05, **P< 0.01. HCD group vs the HCD+Cu2+group, #P< 0.05, ##P< 0.01.Fig.4　Changes of BACE1 expression in the brain tissues of the rabbit n=8)

2.6　各组WHBE兔脑组织中p-tau表达的变化

免疫组化染色显示HCD组、HCD+Cu2+组和老年组WHBE兔脑皮质和海马组织中p-tau染色阳性表达比正常对照组明显增加；定量分析显示，HCD组、HCD+Cu2+组和老年组WHBE兔脑皮质和海马组织中p-tau阳性表达百分率均显著高于正常对照组(P<0.05，P<0.01)；另外，HCD+Cu2+组WHBE兔脑皮质和海马组织中p-tau阳性表达百分率均显著高于HCD组(P<0.05,P<0.01)(图5)。

注：A. 各组脑皮质和海马组织中p-tau染色代表图(×400)；B. 各组p-tau阳性表达百分率与正常对照组比，*P< 0.05, **P< 0.01；HCD组与HCD+Cu2+组比较，#P< 0.05, ##P< 0.01。图5　各组WHBE兔脑组织中p-tau表达的变化Note. A. Representative p-tau-staining images in the cortex and the hippocampus (×400). B. The percentage of positive p-tau expression area. Compared with the group, *P< 0.05, **P< 0.01. HCD group vs HCD+Cu2+group, #P< 0.05, ##P<0.01.Fig.5　Changes of p-tau expression in the brain tissues of the rabbit n=10)

2.7　各组WHBE兔脑组织老年斑和神经纤维缠结的观察

刚果红染色可反映老年斑沉积，结果显示，正常对照组WHBE兔脑皮质和海马区未见红色斑块样物质沉积；HCD组、HCD+Cu2+组和老年组WHBE兔脑皮质和海马区可见有大量的红色斑块样物质沉积，主要沉淀在细胞外(图6A)；Bielschowsky染色可反映神经纤维缠结，结果显示，正常对照组WHBE兔脑皮质和海马区未见黑色银染的物质沉积；HCD组、HCD+Cu2+组和老年组WHBE兔脑皮质和海马区可见有大量的火焰状或球形的黑色银染的物质即为神经纤维缠结(图6B)。

3　讨论

本研究发现WHBE兔给予2%高胆固醇饲料12周后产生明显的高胆固醇血症、血浆Aβ1-42升高、氧化损伤、脑内Aβ沉积增多和tau病理学等改变，且发现给予2%高胆固醇饲料同时添加微量铜饮水能进一步加重氧化损伤，其AD的形态和病理表现更为突出，而这与Sparks等[8]的研究较为一致。上述实验结果提示，高胆固醇血症能加剧AD的病理进程，同时脑内铜代谢水平也与AD的进展有关，符合临床显示AD患者脑内老年斑中有胆固醇沉积[14]，并在老年斑中心及周围也存在高浓度的铜离子[15]；表明高胆固醇血症是AD发生的一个重要危险因素。另外，在36～48月龄的老年WHBE兔中也观察到轻微的高胆固醇血症、氧化损伤、脑内Aβ沉积增多和tau病理学等改变，表明年龄因素也是AD发生的危险因素[16]。同时，一般观察显示高胆固醇饲料或复合添加微量铜饮水的WHBE兔有表现出眼睑半闭等精神恍惚的症状，甚至出现前肢肌肉无力的病症，这与肌肉无力会增加老年人患AD的风险符合。可见，高胆固醇饲料或复合添加微量铜饮水能诱发WHBE兔散发性AD模型的形成。

众所周知，胆固醇作为神经元细胞膜的基本成分之一，与Aβ代谢及异常聚集密切相关[17]。若脑内胆固醇水平过高，使得神经元细胞膜的脂质循环减慢，导致Aβ生成和聚集增加。Helmuth等[18]发现血中胆固醇每升高10%，脑内Aβ沉积就相应增加1倍。相反，给予他汀类药物降低胆固醇水平的同时，也能使AD的发生率降低60%～70%[19]。这些现象与本研究结果较为一致：无论老年期还是高胆固醇饮食的WHBE兔，不仅循环中胆固醇和Aβ水平均升高，同时也存在脑内Aβ染色阳性的高表达和刚果红染色老年斑增多，提示高胆固醇血症影响Aβ代谢和Aβ异常聚集增加。

高胆固醇血症与Aβ生成有关，但其机制还尚不清楚。目前认为，高胆固醇血症能提高分泌酶与β分泌酶的活性，促进淀粉样前体蛋白的代谢，加剧Aβ沉积和老年斑的形成，导致AD的发生[20]。β-分泌酶(BACE1)是启动Aβ生成的第一个蛋白酶，主要定位于脂筏上，并依赖于胆固醇代谢。其中富含胆固醇的脂筏是Aβ产生和聚集的主要原因。高胆固醇血症促进Aβ水平升高与BACE1表达增加有关[21]；在散发性AD患者中BACE1活性也明显上调，而在敲除BACE1基因的小鼠不产生Aβ，且表型正常[22,23]。本研究也发现老年期或高胆固醇饮食的WHBE兔脑内BACE1阳性表达明显上调，且在高胆固醇饮食并添加微量铜饮水的WHBE兔脑内表达增加更为显著，提示高胆固醇血症激活了BACE1裂解酶活性，促进APP淀粉样裂解途径，最终导致Aβ沉积增多。

同样，高胆固醇血症也可引起氧化应激介导的DNA损伤[24]，氧化应激还可促进Aβ聚集，并通过凋亡途径损伤神经元，而抗氧化物酶和维生素E可拮抗这种作用[25]。SOD是公认氧自由基清除剂之一，MDA含量是反映自由基产生量和氧化应激反应程度的敏感指标[26]。本研究结果显示，高胆固醇饮食或复合添加微量铜饮水的WHBE兔以及老年期的WHBE兔表现出脑内SOD活性降低，MDA含量升高，存在明显的氧化应激，表明氧化应激参与了AD的病理过程。

除Aβ病理外，tau蛋白过度磷酸化也是AD患者脑内的又一病理性特征。tau蛋白是一种微管相关蛋白，具有促微管形成和稳定性的作用。在正常状态下tau蛋白呈适度的磷酸化，但在AD患者中由于tau蛋白过度磷酸化，降低了微管组装的能力，引起微管解聚，影响胞体和轴突树突间的运输、引起神经元突起断裂或变形解体，继发神经元退行性病变，导致NFTs[27]。本研究也发现，无论老年期还是高胆固醇饮食的WHBE兔脑内tau蛋白的磷酸化明显增加，且在给予高胆固醇饮食的基础上添加微量铜饮水的WHBE兔脑内tau蛋白的磷酸化进一步加剧，同时，Bielschowsky染色显示脑内NFT明显增加，表明散发性WHBE兔AD模型脑内存在tau蛋白过度磷酸化进程，导致NFT形成。

本研究仍存在一定局限性，尽管Schreurs等[11]已报道了高胆固醇饲料或添加微量铜饮水诱导AD模型兔学习记忆功能的障碍，但本研究仅观察了WHBE兔AD模型的一般行为活动，缺乏学习记忆能力的评估，仍需后期进一步完善WHBE兔AD模型的行为学评价。

综上所述，高胆固醇饮食或复合添加微量铜饮水能诱导散发性AD模型WHBE兔脑部明显的AD病理学变化，包括氧化损伤、脑内Aβ沉积增多、老年斑和tau病理学等改变，WHBE兔可用于神经退行性疾病动物模型的研究。