兔抗狨猴IgG-HRP标记抗体的制备及初步鉴定

丛日旭，刘先菊，滕永康，向志光，佟　巍，张丽芳，阮研硕，刘云波

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京　100021)

普通狨猴(common marmoset,Callithrixjacchus)属于灵长目(primates)狨猴科(callitrichidae)由于具有独特的微小体型、多胎繁殖、易在笼具环境里饲养及操作方便、与人类细胞因子或激素的存在交叉反应、独特的行为和认知特点等优点[1-2]，被不同生物医学研究领域的研究学者们广泛关注，是脑发育、行为学、病毒学、免疫学、生殖生理等学科的重要实验动物模型[3-5]，尤其是近年来在神经学科方面的研究价值，已逐渐得到有关学者的关注及认可。此外，自2009年以来，国外有关学者陆续报道了转基因狨猴[6-7]，随着“帕金森综合征”等转基因狨猴的问世这一突破性进展，又为生物医学的深入探索性研究提供了重要的实验动物模型，狨猴也因此将进一步发挥它的研究价值。但由于普通狨猴及其他非人类灵长类患病种类繁多，为了排除患病个体，保障人员安全与提高实验的准确性，需要建立相应的诊断方法。其中血清学方法是诊断疾病的有效手段之一。

本文鉴于“狨猴微生物、寄生虫学检测标准制定”，制备了兔抗狨猴IgG-HRP并对其工作浓度初步鉴定,为狨猴病原微生物及突发传染病的血清学检测体系、制定实验用狨猴病原微生物标准提供了技术资源。

1　材料和方法

1.1　实验动物

狨猴5只，3～4岁，体重280～340 g，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供[SCXK(京)2014-0011] [SYXK(京)2017-0027]，实验动物伦理委员会批准号：LYB18003。饲养在实验动物资源北方中心慢病间狨猴饲养室(普通环境)。

1.2　主要试剂及仪器

弗氏完全佐剂(Sigma，F5881)；辣根过氧化物酶HRP(Sigma, P2088)；BCA试剂盒(Thermo，23227)；琼脂糖(Biowest，111860)；脱脂奶粉(BD，232100)；TMB (Solarbio, PR1200)；分子蛋白量标准(Thermo Fisher，26619)；Western blotting显色底物(Millipore，WBKLS0500)。

低温离心机(Thermo，Heraeus Freso 21 centrifuge)；蛋白分离纯化系统(Bio-Rad，DUO-FLOW)；电泳仪(Bio-Rad,163BR10305)；酶标仪(Perkin Elmer EnSpire® 2300 Multimode Plate Reader)；全自动化学发光成像分析系统(Tanon 5500)；HiTrapTMProtein G(GE Healthcare，71-7001-00 AR)；Sephacryl TM S-300 High Resolution(GE Healthcare，17-0599-10)。

1.3　实验方法

1.3.1血清的收集

根据实验动物操作规范,保定狨猴，消毒，采集后肢静脉血，并结束时压迫止血，将血液放于室温静置1.5 h后，低温离心机4℃，4000 r/min，离心20 min，吸取上层血清。

1.3.2狨猴血清IgG纯化和纯度鉴定

亲和层析柱法是利用生物大分子在一定条件下能紧密的结合(抗原-抗体)，可以将目的抗原从溶液中转移和分离和提纯。参考文献报道的方法[9-13]。安装预处理的亲和层析柱Protein G 5 mL，紫外监测设为0.05，血清用20 mmol/L，pH 7.0 PBS结合缓冲液(binding buffer)4.5倍稀释后过滤(0.45 μm NC)，上样速度设为1 mL/min，用50 mL (10倍柱体积(CV))的结合缓冲液洗去未与protein G结合的杂蛋白，25 mL(5倍CV)的0.1 mol/L，pH 2.7甘氨酸洗脱液洗脱目的蛋白即狨猴IgG，接收洗脱峰。合并各管蛋白溶液，BCA法测定蛋白含量。

10% SDS-PAGE电泳鉴定亲和层析纯化狨猴IgG的纯度是否符合免疫原的条件。

1.3.3狨猴抗血清的制备和纯化

用1.3.2纯化的狨猴IgG作为免疫原，对健康成年新西兰大白兔进行免疫[14],初次免疫采用IgG剂量为每次0.5 mg，与弗氏完全佐剂1∶1混合,采用背部多点皮下注射法每点0.1～0.2 mL，一只动物注射点数约为8～10点，共计注射每只1 mL。两周后采用IgG剂量为每次0.25 mg，加强免疫3次，免疫方法同初次免疫。免疫结束1周后,保定采血(兔耳缘静脉)， 4000 r/min，20 min，分离血清。

Double immunodiffusion assay, 1%琼脂糖对血清效价进行测定。

兔抗狨猴抗血清纯化及鉴定按照1.3.2进行。

1.3.4兔抗狨猴IgG-HRP的制备和工作浓度测定

采用改良的“简易过碘酸钠(NaIO4)标记法”[15]制备兔抗狨猴IgG-HRP。

1.3.4.1用ELISA法测定标记抗体的工作浓度[14]

将亲和纯化的狨猴IgG，稀释成10 μg/mL每孔加100 μL(每孔1 μg)，包被96孔酶标板，酶标抗体作倍比系列稀释(1∶8000，1∶16 000，……1∶512 000)，每孔100 μL分别加入酶标板；温箱孵育(37℃，1 h)-洗涤-显色(TMB)-终止反应(H2SO4)-读取OD值(450 nm)，当OD值等于1.0时对应的兔抗狨猴IgG-HRP稀释度，为酶标抗体的适宜工作浓度。

1.3.4.2用Western blotting法[9, 10, 14]检测兔抗狨猴IgG-HRP及狨猴IgG工作浓度

亲和纯狨猴IgG，上样量分别为25、20、15、10、5、2.5 ng；进行10% SDS-PAGE电泳，100 V，2 h；电转PVDF膜，110 V，1 h，将兔抗狨猴IgG酶标抗体用PBST+5%脱脂奶粉(1∶1)做系列稀释1∶5000、1∶10 000、1∶15 000，与IgG-PVDF孵育(1 h)，洗涤，曝光成像留取结果。

2　结果

2.1　狨猴IgG的亲和层析纯化

紫外检测仪显示出到两个蛋白质吸收峰：结合缓冲液洗脱的血清中未与protein G亲和柱结合的蛋白所显示的峰(穿流峰)(见图1a)；洗脱缓冲液使目的蛋白IgG与亲和层析柱分离的峰(洗脱峰)(见图1b)。收集洗脱峰的液体是与亲和柱结合的狨猴IgG。

注：(a)穿流峰；(b)洗脱峰。图1　狨猴IgG亲和纯化紫外监测峰图Note：(a)Passing through the peak.(b)Elution peak.Fig.1　UV-monitoring of the marmoset IgG purified using protein G affinity chromatography

2.2　狨猴IgG的SDS-PAG电泳分析

还原的亲和层析狨猴血清IgG(100℃，4 min)，经10%SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)R250染色，脱色观察结果，其纯度可大于95%(见图2)，除重链(55×103)和轻链(25×103)，上样量达到30 μg时未见杂蛋白(见图2，Lane 4所示)。染色结果说明亲和层析Protein G与狨猴血清IgG具有较强的结合力，形成了紧密复合物，得到高纯度的狨猴IgG。

注: M为分子蛋白量标准; Lane 1为狨猴血清；Lane 2为穿流峰蛋白；Lane 3～5亲和纯狨猴，IgG加样量为20 μg，30 μg，10 μg。图2　狨猴血清IgG纯度电泳鉴定Note. M: Standard protein marker. Lane 1: The complete serum of marmoset; Lane 2: Washed off protein. Lane 3-5: Samples from the protein G affinity chromatograph added 20 μg, 30 μg, and 10 μg loading amount, respectively.Fig.2　Detection of IgG from the marmoset serum purified by affinity chromatography

2.3　狨猴IgG抗血清的效价检测及纯度分析

1.3.3中的兔抗狨猴IgG的血清，中央孔加入1 mg/mL 纯化狨猴IgG 10 μL，1～6分别加入10 μL不同倍比稀释的抗血清，放入湿盒内37℃，18 h后观察抗原、抗体的特异性复合物的白色沉淀线，由图可见抗血清的效价达到了1∶64(见图3 A)。

Protein G亲和层析纯化兔抗狨猴IgG抗血清的还原型IgG，经10% SDS-PAGE电泳鉴定(见图3B)，亲和层析的得到高纯度的抗血清IgG，其纯度大于97%。实验结果满足制备酶标抗体的基本要求：抗体纯度高、含杂蛋白少、特异性强、效价高。

注：A:兔抗狨猴IgG血清免疫双扩散效价；B: M为分子蛋白量标准，Lane 1～7抗血清纯化IgG，上样量为30、25、20、15、10、5、2.5 μg。图3　兔抗狨猴IgG抗体效价检测和纯化Note. A: Double-immunodiffusion of the anti-serum for IgG of marmoset. B: M was standard protein marker. Lane 1-7: The antiserum from the protein-G affinity chromatograph added 30 μg, 25 μg, 20 μg, 15 μg, 10 μg, 5 μg, and 2.5 μg loading amount, respectively.Fig.3　Purification of the rabbit anti-marmoset IgG antibody

2.4　ELISA法测定兔抗狨猴IgG酶标抗体的工作浓度

与狨猴IgG反应的不同稀释度的兔抗狨猴IgG-HRP酶标抗体，OD值分别为3.728、3.705……0.584(见图4)由此可见,以1∶256 000稀释时,其OD值为1.037,即1∶256 000为兔抗狨猴IgG-HRP酶标抗体的稀释度。

图4　兔抗狨猴IgG-HRP ELISA效价测定Fig.4　Determination of the rabbit anti-marmoset IgG-HRP titer by direct ELISA

2.5　Western blotting法检测酶标记抗体及狨猴IgG工作浓度

PVDF膜曝光结果，以1∶15 000稀释的酶标抗体孵育，并在狨猴IgG加样量为5 μg可以显示清晰、特异的印迹反应(见图5)，酶标抗体灵敏度较强，1∶15 000兔抗狨猴IgG-HRP稀释度及5 μg的IgG可作为Western blotting的最适起始工作浓度。

注：兔抗狨猴IgG酶标抗体稀释度为1∶15 000，曝光时间10 s显色；M为蛋白分子量标准； Lane 1～6：亲和纯狨猴IgG：25、20、15、10、5、2.5 μg。图5　兔抗狨猴IgG酶标抗体及狨猴IgG 的western blotting工作浓度测定Note. Western blot result of the marmoset IgG specifically responding with 1:15 000 rabbit anti-marmoset IgG-HRP. M: Standard protein marker. Lane 1-6: Samples from the protein-G affinity chromatograph were added 25 μg, 20 μg, 15 μg, 10 μg, 5 μg, and 2.5 μg，respectively.Fig.5　Determination of the working concentration of the rabbit anti-marmoset IgG-HRP and Marmoset IgG by western blotting

3　讨论

标记抗体是免疫技术的关键试剂，其质量主要取决于标记抗体的纯度、敏感性及特异性。本文力求采用高质量的辣根过氧化物酶与高效价、HPLC纯的兔抗狨猴IgG，通过改良的“简易过碘酸钠标记法”制备了兔抗狨猴IgG-HRP酶标抗体，经过自装的SephacrylTMS-300 High Resolution柱子进行分子过滤纯化、低温超滤离心透析浓缩，获得高质量的兔抗狨猴IgG-HRP酶标抗体，经ELISA及Western blotting进行鉴定，其纯度、敏感性及特异性均符合使用要求。

如图1所示，用高效液相色谱亲和层析法 (high performance liquid affinity chromatography，HPLC)及HiTrapTMProtein G HP亲和柱纯化得到狨猴血清总IgG，经SDS-PAGE电泳鉴定，其纯度95%(见图2)；免疫兔子获得兔抗狨猴IgG抗血清(即狨猴IgG多克隆抗体， whole IgG PcAb)，免疫双扩散测定抗血清效价为1∶64(见图3A)；再用亲和柱纯化抗血清IgG，PAGE电泳鉴定HPLC纯度97%(见图3B)。本文目的是制备了兔抗狨猴IgG-HRP标记抗体，其 ELISA工作浓度达1∶256 000(见图4)，Western blotting工作浓度达1∶15 000，且具有较强的特异性(见图5)。

本文初步制备了抗狨猴IgG-HRP酶标抗体结合物，随着“狨猴微生物、寄生虫学检测标准制定”工作的不断深入和技术试剂的需求，会继续制备有关抗狨猴IgG的各种发光标记抗体、各种酶标记抗体及胶体金标记抗体，以适用于诸如酶组化技术(APAAP)、酶免疫技术(EA)、酶联免疫技术(ELISA)、荧光免疫技术(FITC)、化学发光免疫技术、免疫胶体金技术(GICT)、流式细胞术技术(FCM)、以及Western blotting等技术，以满足生物医学研究领域及狨猴病原微生物检测的各种需求。

本文最终强调，实验动物是实验动物科学的重要组成，是生命科学的基础支撑、活的“精密仪器”，而实验动物的标准化和动物实验的规范化研究势必会成为实验动物科学的重要工作。在我国，狨猴至今仍被定义为“实验用动物”，即狨猴作为诸多学科研究用的非人灵长类实验动物，目前尚无国家、行业或地方标准的推出。鉴于目前国内市场抗狨猴IgG-HRP酶标抗体的缺乏及“实验用狨猴地方标准和相关检测技术研究”、“狨猴微生物、寄生虫等级监测地方标准”制定、以及狨猴其他研究工作之所需，实时有效地完成了兔抗狨猴IgG-HRP标记抗体的制备及初步鉴定，为狨猴的血清学检测提供了资源。